Misurazione della extracellulare Ion Flussi Utilizzando il ionoselettivo autoreferenziale microelettrodo Tecnica
Summary
Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.
Abstract
Le cellule ottenute da animali, piante e cellule singole sono racchiusi da una barriera chiamato la membrana cellulare che separa il citoplasma dall'esterno. Strati cellulari come epiteli formano anche una barriera che separa l'interno dall'esterno o diversi compartimenti di organismi multicellulari. Una caratteristica fondamentale di queste barriere è la distribuzione differenziale di ioni attraverso le membrane cellulari o strati di cellule. Due proprietà consentono questa distribuzione: 1) membrane e epiteli mostrano permeabilità selettiva di ioni specifici; 2) gli ioni sono trasportati attraverso le pompe attraverso le membrane cellulari e strati di cellule. Queste proprietà giocano un ruolo cruciale nel mantenimento della fisiologia dei tessuti e fungono da segnalazione spunti dopo i danni, durante la riparazione, o in condizioni patologiche. L'auto-riferimento microelettrodo ionoselettivo consente misurazioni di flussi specifici di ioni come calcio, potassio o sodio a livelli cellulari e tissutali singoli. Il microelettrodo contiene un cocktail ionoforo che èselettivamente permeabile ad uno ione specifico. La soluzione di riempimento interna contiene una concentrazione insieme di ione di interesse. Il potenziale elettrico del microelettrodo è determinata dalla concentrazione fuori dello ione. Poiché la concentrazione di ioni varia, il potenziale del microelettrodo cambia in funzione del log della attività ionica. Quando spostato avanti e indietro vicino a una fonte o affondare dello ione (cioè in un gradiente di concentrazione dovuto al flusso di ioni) il potenziale microelettrodo oscilla ad una ampiezza proporzionale al flusso di ioni / gradiente. L'amplificatore amplifica il segnale microelettrodo e la produzione è registrata sul computer. Il flusso di ioni può essere calcolata dalla legge di Fick della diffusione usando le fluttuazioni potenziale dell'elettrodo, l'escursione di microelettrodo, e altri parametri quali la mobilità ionica specifico. In questo articolo, si descrive nel dettaglio la metodologia per misurare flussi ionici extracellulari con il autoreferenziale microelettrodi uno ione-selettivod presentare alcuni risultati rappresentativi.
Introduction
Tutte le cellule animali sono circondate da una membrana a doppio strato lipidico che separa il citoplasma dall'ambiente esterno. La cella mantiene un potenziale di membrana elettrico, negativa all'interno, dal trasporto attivo di ioni 1. Il potenziale di membrana è una fonte di energia accumulata che la cellula può utilizzare per operare vari dispositivi molecolari nella membrana 2. I neuroni e le altre cellule eccitabili hanno grandi potenziali di membrana. Rapid apertura dei canali del sodio crolla il potenziale di membrana (depolarizzazione) e produce il potenziale di azione che viene trasportato lungo la lunghezza del neurone 2. Oltre a questi cambiamenti rapidi elettrici, molti tessuti e organi generare e mantenere significativi potenziali elettrici a lungo termine. Ad esempio, la pelle e dell'epitelio corneale generare e mantenere potenziali trans-epiteliali e correnti elettriche extracellulari pompando direzionale di ioni (soprattutto sodio e cloruro) 3.
tenda "> Mentre misure di corrente elettrica endogena extracellulare utilizzando la sonda vibrante 4-6 e le misurazioni dei potenziali di membrana o trans-epiteliali utilizzando il sistema microelettrodo 7-10 consentire la misurazione dei parametri elettrici di membrane cellulari e strati di cellule epiteliali, non danno indicazione della specie ionici coinvolti.Microelettrodi con ionophore selettivo in grado di misurare la concentrazione di ioni in soluzione specifica. Gradienti ionici o flusso possono essere misurati con due o più elettrodi in posizioni diverse. Tuttavia, la deriva della tensione intrinseca di ciascuna sonda sarebbe diversa, causando misurazioni imprecise o anche il rilevamento di un gradiente che non era presente. Un singolo elettrodo utilizzato in modalità "auto-riferimento" in cui si muove a bassa frequenza tra due punti risolve questo problema. Ora il flusso di ioni può essere visto sullo sfondo di una deriva del segnale relativamente lento e stabile (vedere Figura 3B). </p>
Il sistema di misurazione sensibile agli ioni utilizza microelettrodi autoreferenziali ionoselettivi di rilevare piccoli flussi extracellulari di ioni nei pressi di tessuti o cellule singole. Il sistema è costituito da un amplificatore che elabora il segnale dal microelettrodo e un motore passo-passo micro e guidatore a controllare il movimento del microelettrodo. Il microelettrodo ione-selettivo e l'elettrodo di riferimento che chiude il circuito sono collegati all'amplificatore tramite un headstage preamplificatore (Figura 1A). Software determina i parametri del movimento microelettrodo (frequenza, distanza) e registra anche l'uscita dell'amplificatore. Il motore passo-passo controlla il movimento tramite un microelettrodo micropositioner tridimensionale. Una bassa frequenza di oscillazione microelettrodi ione-selettivo è stato sviluppato nel 1990 per misurare il flusso di calcio specifica 11. Così come il calcio, cocktail ionofori accessibili in commercio sono ora disponibili a fare microelectrodes sensibile al sodio, cloruro, potassio, idrogeno, magnesio, nitrato, ammonio, fluoruro, litio o mercurio.
Fondamentalmente, la tecnica microelettrodo ionoselettivo autoreferenziale converte l'attività di uno ione specifico disciolto in una soluzione in un potenziale elettrico, che può essere misurata con un voltmetro. Il cocktail ionoforo è un liquido immiscibile fase (organica, lipofila) con proprietà a scambio ionico. L'ionoforo complessi selettivamente (binding) ioni specifici reversibilmente e li trasferisce tra la soluzione acquosa contenuta nel microelettrodo (elettrolita) e la soluzione acquosa in cui è immerso il microelettrodo (Figura 1D). Questo trasferimento di ioni porta un equilibrio elettrochimico e una variazione di potenziale elettrico tra il microelettrodo e l'elettrodo di riferimento è misurata dal voltmetro. La tensione è proporzionale al logaritmo dell'attività ione specifico secondo l'Nernst equation consentendo il calcolo della concentrazione di ioni (Figura 2A e B).
Attualmente, alcuni sistemi permettono la misurazione del flusso ionico usando un concetto o principio simile. Ad esempio, l'elettrodo tecnica di scansione ionoselettivo (SIET) 12,13 o il (MIFE) tecnica microelettrodo Ion Flux Stima sviluppata da Newman e Shabala 14-16 sono disponibili in commercio e ampiamente utilizzati dalla comunità di ricerca al fine di determinare ione specifico fondenti si verificano a membrana e tessuti cellulari attraverso una varietà di animali, piante e modelli a cella singola vita. Microelettrodi ionoselettivi sono stati utilizzati per misurare l'idrogeno, il potassio e il flusso di calcio attraverso le radici delle piante 17, flux cloruro nel ratto arterie cerebrali 18 e in tubetti pollinici 19, flusso di idrogeno in cellule retiniche pattino 20, flusso di calcio nelle ossa del mouse 21, ione vari flussi di ife fungine e 22 in ra 23 della cornea, e, infine, il flusso di calcio durante ferita singola cellula di guarigione 12,24. Si veda anche la seguente recensione per informazioni dettagliate sul ionoselettive autoreferenziali microelettrodi 25.
Il seguente articolo descrive in dettaglio come preparare ed eseguire la misurazione di flussi ionici endogeni extracellulari utilizzando l'autoreferenziale tecnica microelettrodi ionico selettivo a livello di singola cellula.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le fasi più critiche per la misurazione successo flussi ionici extracellulari in vivo sono: la riduzione del rumore, la corretta realizzazione dell'elettrodo microelettrodi ionoselettivi e riferimento, e il posizionamento del campione e due elettrodi.
Per minimizzare il rumore, il sistema di registrazione dovrebbe essere collegato a terra (massa) gabbia di Faraday preferibilmente con un (isolamento dalle vibrazioni) Tavolo metallo con ripiano che è anche collegata a terra. Ino…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Science Foundation grant MCB-0951199, and in part by the NIH grant EY01910, California Institute of Regenerative Medicine grants RB1-01417 and by the Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) grant SFRH/BD/87256/2012.
Materials
| IonAmp | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| IonAmp32 | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Headstage pre-amplifier | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | INA116 | BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| MicroStep Driver | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Manual micropositioner | World Precision Instruments | Model KITE-R | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | Model M10 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Vibration isolation table | Newport Inc. | Model VW-3036-OPT-023040 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces | Newport Inc. | Model 360-90 | Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table |
| Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel | Newport Inc. | 460PD-X | none |
| Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel | Newport Inc. | 460A-XY | none |
| Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament | World Precision Instruments | TW150-4 | none |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | none |
| Metal rack | Made in-house | none | Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel |
| Oven | QL | Model 10 Lab Oven | none |
| Silanization solution I | Sigma-Aldrich | 85126 | Hazardous, handle as recommended by provider |
| Glass Petri dish; Pyrex | Fisher Scientific | 316060 | none |
| Electrode/micropipette storage jar | World Precision Instruments | E215 | none |
| Glass dessicator | Fisher Scientific | 08-595E | Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight. |
| Plastic Pasteur pipette | Fisher Scientific | 11597722 | none |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | S97329 | none |
| Microscope slide | Sigma-Aldrich | S8902 | none |
| Straight microelectrode holder | Warner Instruments | QSW-A15P | with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire |
| Straight microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH3S | with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector |
| 6 cm Petri dish | VWR | 60872-306 | none |
| Nitex mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX750 | none |
| Glue; Loctite epoxy | VWR | 500043-451 | Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing |
| Deionized water | Sigma-Aldrich | 99053 | none |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | none |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | none |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | none |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | none |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | none |
| Sodium Hydroxyde | Sigma-Aldrich | S8045 | none |
| Potassium Acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | none |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | none |
References
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