İyon seçici Kendinden referans Mikroelektrod Tekniği Ekstraselüler Ion eriticiler Ölçümü
Summary
Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.
Abstract
Hayvan, bitki ve tek hücre hücreler dışarıdan sitoplazma ayıran hücre zarı olarak adlandırılan bir bariyer ile kapatılmıştır. Örneğin epitelde gibi hücre tabakaları da dış ya da çok hücreli organizmaların farklı kompartmanların iç ayıran bir bariyer oluşturur. Bu engellerin önemli bir özelliği, hücre membranları veya hücre tabakaları iyonların ayırıcı dağılımıdır. İki özellikleri bu dağılımı sağlar: 1) membranlar ve epitel belirli iyonların seçici geçirgenliğini gösterir; 2) iyonları hücre zarları ve hücre katmanları arasında pompa aracılığıyla taşınmaktadır. Bu özellikler, doku fizyolojisini korunmasında önemli rol oynarlar ve tamir sırasında, hasar sonrası ipuçlarını sinyal olarak hareket ya da patolojik koşullarda. iyon seçici kendi kendine referans mikroelektrot bu tip bir tekli hücre ve doku seviyelerinde kalsiyum, potasyum veya sodyum gibi iyonların özel tozlar ölçümleri sağlar. mikroelektrot bir iyonofor kokteyl içerirBelirli bir iyon seçici olarak geçiren. İç dolgu çözüm ilgi iyon bir dizi konsantrasyonunu içerir. mikroelektrot elektrik potansiyeli iyonunun dışında konsantrasyonu ile belirlenir. Iyon konsantrasyonu değişir, mikroelektrot potansiyeli iyon aktivitesinin günlüğünün bir fonksiyonu olarak değişir. (Nedeniyle iyon akı bir konsantrasyon gradyanı yani) ileri ve geri iyonu kaynağı veya lavabonun yanında taşındığında mikroelektrod potansiyeli iyon akışı / degrade orantılı bir genlikte dalgalanır. amplifikatör mikroelektrot sinyalini güçlendirir ve çıkış bilgisayarda kaydedilir. iyon akışı daha sonra spesifik iyon hareketliliği olarak elektrot potansiyel dalgalanma, mikroelektrot gezi ve diğer parametreleri kullanarak difüzyon Fick'in yasayla hesaplanabilir. Bu yazıda iyon seçici self-referencing mikroelektrod An kullanarak dışı iyon akıları ölçmek için metodoloji detaylı tarifbazı temsilcisi sonuçlarını sunmak d.
Introduction
Tüm hayvan hücreleri dış çevreden sitoplazma ayıran bir lipid iki katmanlı zar ile çevrelenmiştir. Hücre iyonlarının 1 aktif taşıma ile, içinde bir elektrik membran potansiyelini negatif tutar. membran potansiyeli hücre zarında 2 çeşitli moleküler cihazları çalıştırmak için kullanabileceği bir depolanmış enerji kaynağıdır. Nöronlar ve diğer heyecanlı hücrelerin büyük zar potansiyelleri var. Sodyum kanallarının hızlı açılış membran potansiyeli (depolarizasyon) çöker ve nöron 2 uzunluğu boyunca taşınır aksiyon potansiyeli oluşturur. Bunların yanı sıra hızlı elektrikli değişikliklerden birçok doku ve organları oluşturmak ve uzun vadede önemli elektrik potansiyellerini korumak. Örneğin, deri ve kornea epitel oluşturmak ve iyonların yönlü pompalama (özellikle, sodyum ve klorid) 3 trans-epitel potansiyelleri ve hücre dışı elektrik akımı muhafaza.
endojen hücre dışı elektrik akımı ölçümleri titreşimli prob 4-6 ve hücre zarlarının ve epitel hücre katmanlarının elektrik parametrelerinin ölçümünü sağlayan mikroelektrod sistemini 7-10 kullanarak membran veya trans-epitel potansiyellerin ölçümleri kullanırken çadır ">, onlar vermek katılan iyon türlerinin göstergesi.Seçici iyonofor ile Mikroelektronlar çözelti içinde spesifik iyon konsantrasyonunu ölçebilirsiniz. İyon gradyanları ya da akışkan farklı konumlarda iki veya daha fazla elektrot ile ölçülebilir. Ancak, her sonda içsel gerilim sürüklenme, farklı olabilir yanlış ölçüm ya da mevcut olmayan bir degrade bile tespit sebep olacaktır. İki nokta arasındaki düşük frekansta hareket sayede "self-referans" modunda kullanılan tek bir elektrot bu sorunu çözer. Şimdi iyon akışı nispeten yavaş ve istikrarlı sinyal sürüklenme arka planı görülebilir (Şekil 3B). </p>
iyona duyarlı bir ölçüm sistemi doku veya tek hücre yakın iyonlarının küçük bir hücre-dışı akıları tespit etmek için iyon seçici kendinden referans Mikroelektronlar kullanır. Sistem mikroelektrot hareketini kontrol etmek mikroelektrot ve mikro step motor ve sürücü sinyali işleyen bir amplifikatör oluşur. devresini kapatmak iyon seçici mikroelektrot ve ayrıca referans elektrotu bir headstage pre-amplifikatör (Şekil 1A) ile amplifikatöre bağlanır. Bilgisayar yazılımı Mikroelektrot hareketi (frekans, mesafe) parametrelerini belirler ve ayrıca amplifikatör çıkışını kaydeder. adım motoru, üç boyutlu bir micropositioner ile mikroelektrot hareketini kontrol eder. Iyon seçici mikroelektrot titreşimli düşük frekanslı ilk belirli kalsiyum akı 11 ölçmek için 1990 yılında geliştirilmiştir. Yanı sıra kalsiyum gibi, ticari erişilebilir iyonofor kokteyller şimdi MICR yapmak için kullanılabiliroelectrodes sodyum, klorür, potasyum, hidrojen, magnezyum, nitrat, amonyum, florür, lityum ya da cıva duyarlı.
Temel olarak, kendi kendine referans iyon seçici mikroelektrot tekniği, bir voltmetre ile ölçülebilir bir elektrik potansiyel bir çözelti içinde çözündürüldü, belirli bir iyon aktivitesini dönüştürür. iyonofor kokteyli karışmayan sıvı iyon-değişim özelliklerine sahip (organik, lipofilik) aşamasıdır. iyonofor seçici (bağlar) belirli bir iyonlar, tersine çevrilebilir şekilde ve mikroelektrot (elektrolit) içerdiği, sulu çözeltisi ve mikroelektrot daldırılmış olduğu bir sulu çözelti (Şekil 1D) arasındaki aktarma çalışmalarının kompleksleri. Bu, iyon aktarımı, bir elektro-kimyasal denge yol açar ve mikroelektrot ve referans elektrot arasında elektrik potansiyeli değişimi voltmetre ile ölçülür. Gerilim Nernst e göre özel iyonu aktivitesinin logaritması ile orantılı olduğuiyon konsantrasyonu (Şekil 2A ve B) hesaplanmasını sağlayan quation.
Şu anda, birkaç sistemler benzer bir kavram ya da ilke kullanarak iyon akışının ölçümü sağlar. Örneğin, Newman ve Shabala 14-16 tarafından geliştirilen tarama İyon seçici elektrot Tekniği (SIET) 12,13 veya Mikroelektrod Ion Akı Tahmini (MIFE) tekniği piyasada mevcut ve yaygın belirli iyonu belirlemek amacıyla araştırma topluluğu tarafından kullanılmaktadır hayvan, bitki ve tek canlı hücre modelleri çeşitli genelinde hücre zarı ve doku meydana gelen akıları. İyon seçici Mikroelektronlar serebral arter farede 18 ve polen tüpleri 19, paten retina hücreleri 20 hidrojen akı, fare kemik 21, çeşitli iyon kalsiyum akışının hidrojen, potasyum ve kalsiyum akısını bitki köklerine 17 arasında, klorür akının ölçülmesi için kullanılmıştır mantar hif 22 ve r akılarıTek hücreli yara sırasında kornea 23 ve son olarak kalsiyum akı ile 12,24 şifa. Ayrıca iyon seçici kendinden referanslı Mikroelektronlar 25 hakkında detaylı bilgi için aşağıdaki gözden bakın.
aşağıdaki makale hazırlamak ve tek hücre düzeyinde iyon seçici self-referencing mikroelektrod tekniği kullanılarak endojen hücre dışı iyon akıları ölçümünü nasıl gerçekleştirileceği detaylı olarak anlatılmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
in vivo olarak, hücre dışı, iyon akıları başarılı ölçümü için en kritik adımlar şunlardır: gürültüsünün azaltılması, iyon seçici Mikroelektronlar ve referans elektrotunun doğru imalatı, ve örnek ve her iki elektrot arasında konumlandırılması.
Gürültüyü en aza indirmek için, kayıt sistemi, tercihen de topraklı bir metal tepesinde (titreşim izolasyon) tablosu ile topraklı (topraklı) Faraday kafesi olmalıdır. Buna ek olarak, mikroskop şasi d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Science Foundation grant MCB-0951199, and in part by the NIH grant EY01910, California Institute of Regenerative Medicine grants RB1-01417 and by the Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) grant SFRH/BD/87256/2012.
Materials
| IonAmp | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| IonAmp32 | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Headstage pre-amplifier | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | INA116 | BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| MicroStep Driver | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Manual micropositioner | World Precision Instruments | Model KITE-R | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | Model M10 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Vibration isolation table | Newport Inc. | Model VW-3036-OPT-023040 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces | Newport Inc. | Model 360-90 | Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table |
| Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel | Newport Inc. | 460PD-X | none |
| Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel | Newport Inc. | 460A-XY | none |
| Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament | World Precision Instruments | TW150-4 | none |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | none |
| Metal rack | Made in-house | none | Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel |
| Oven | QL | Model 10 Lab Oven | none |
| Silanization solution I | Sigma-Aldrich | 85126 | Hazardous, handle as recommended by provider |
| Glass Petri dish; Pyrex | Fisher Scientific | 316060 | none |
| Electrode/micropipette storage jar | World Precision Instruments | E215 | none |
| Glass dessicator | Fisher Scientific | 08-595E | Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight. |
| Plastic Pasteur pipette | Fisher Scientific | 11597722 | none |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | S97329 | none |
| Microscope slide | Sigma-Aldrich | S8902 | none |
| Straight microelectrode holder | Warner Instruments | QSW-A15P | with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire |
| Straight microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH3S | with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector |
| 6 cm Petri dish | VWR | 60872-306 | none |
| Nitex mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX750 | none |
| Glue; Loctite epoxy | VWR | 500043-451 | Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing |
| Deionized water | Sigma-Aldrich | 99053 | none |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | none |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | none |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | none |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | none |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | none |
| Sodium Hydroxyde | Sigma-Aldrich | S8045 | none |
| Potassium Acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | none |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | none |
References
- Weber, W. M., Liebold, K. M., Clauss, W. Amiloride-sensitive Na+ conductance in native Xenopus oocytes. Biochimica et biophysica acta. 1239, 201-206 (1995).
- McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. Journal of cell science. 122, 4267-4276 (2009).
- Zhao, M. Electrical fields in wound healing-An overriding signal that directs cell migration. Seminars in cell & developmental biology. 20, 674-682 (2009).
- Jaffe, L. F., Nuccitelli, R. An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents. The Journal of cell biology. 63, 614-628 (1974).
- Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nature protocols. 2, 661-669 (2007).
- Reid, B., Zhao, M. Measurement of bioelectric current with a vibrating probe. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Moore, J. W. The patch clamp: single-channel recording. Science. 224, 50-51 (1984).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of visualized experiments. , (2008).
- McCaig, C. D., Robinson, K. R. The ontogeny of the transepidermal potential difference in frog embryos. Developmental biology. 90, 335-339 (1982).
- Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F. Detection of extracellular calcium gradients with a calcium-specific vibrating electrode. The Journal of cell biology. 110, 1565-1573 (1990).
- Cai, G., Cresti, M., Moscatelli, A. The use of the vibrating probe technique to study steady extracellular currents during pollen germination and tube growth. Fertilisation in Higher Plants: molecular and cytological aspects. , 235-252 (1999).
- Kunkel, J. G., Xu, Y., Shipley, A. M., Feijó, J. A. The use of non-invasive ion-selective microelectrode techniques for the study of plant development. Plant Electrophysiology – Theory and Methods. (ed Volkov AG. , 109-137 (2006).
- Ordonez, N. M., Shabala, L., Gehring, C., Shabala, S. Noninvasive microelectrode ion flux estimation technique (MIFE) for the study of the regulation of root membrane transport by cyclic nucleotides. Methods in molecular biology. 1016, 95-106 (2013).
- Tegg, R. S., Melian, L., Wilson, C. R., Shabala, S. Plant cell growth and ion flux responses to the streptomycete phytotoxin thaxtomin A: calcium and hydrogen flux patterns revealed by the non-invasive MIFE technique. Plant & cell physiology. 46, 638-648 (2005).
- Newman, I. A. Ion transport in roots: measurement of fluxes using ion-selective microelectrodes to characterize transporter function. Plant, cell & environment. 24, 1-14 (2001).
- Kochian, L. V., Shaff, J. E., Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F., Lucas, W. J. Use of an extracellular, ion-selective, vibrating microelectrode system for the quantification of K(+), H (+), and Ca (2+) fluxes in maize roots and maize suspension cells. Planta. 188, 601-610 (1992).
- Doughty, J. M., Langton, P. D. Measurement of chloride flux associated with the myogenic response in rat cerebral arteries. The Journal of physiology. 534, 753-761 (2001).
- Messerli, M. A., Smith, P. J., Lewis, R. C., Robinson, K. R. Chloride fluxes in lily pollen tubes: a critical reevaluation. The Plant journal : for cell and molecular biology. 40, 799-812 (2004).
- Molina, A. J., et al. Neurotransmitter modulation of extracellular H+ fluxes from isolated retinal horizontal cells of the skate. The Journal of physiology. 560, 639-657 (2004).
- Marenzana, M., Shipley, A. M., Squitiero, P., Kunkel, J. G., Rubinacci, A. Bone as an ion exchange organ: evidence for instantaneous cell-dependent calcium efflux from bone not due to resorption. Bone. 37, 545-554 (2005).
- Lew, R. R. Ionic currents and ion fluxes in Neurospora crassa hyphae. Journal of experimental botany. 58, 3475-3481 (2007).
- Vieira, A. C., et al. Ionic components of electric current at rat corneal wounds. PloS one. 6, e17411 (2011).
- Luxardi, G., Reid, B., Maillard, P., Zhao, M. Single cell wound generates electric current circuit and cell membrane potential variations that requires calcium influx. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 6, 662-672 (2014).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A., Michael, A. C., Borland, L. H. . Electrochemical Methods for Neuroscience. , (2007).
- Smith, P. J., Hammar, K., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Trimarchi, J. R. Self-referencing, non-invasive, ion selective electrode for single cell detection of trans-plasma membrane calcium flux. Microscopy research and technique. 46, 398-417 (1999).
- Messerli, M. A., Smith, P. J. Construction theory, and practical considerations for using self-referencing of Ca(2+)-selective microelectrodes for monitoring extracellular Ca(2+) gradients. Methods in cell biology. 99, 91-111 (2010).
- Chambers, J., Hastie, T., Pregibon, D., Momirović, K., Mildner, V. Ch. 48. Compstat. , 317-321 (1990).
- Chambers, J. M., Cleveland, W. S., Kleiner, B., Tukey, P. A. . Graphical methods for data analysis. , (1983).
- Burkel, B. M., Benink, H. A., Vaughan, E. M., von Dassow, G., Bement, W. M. A Rho GTPase signal treadmill backs a contractile array. Developmental cell. 23, 384-396 (2012).
- Bement, W. M., Mandato, C. A., Kirsch, M. N. Wound-induced assembly and closure of an actomyosin purse string in Xenopus oocytes. Current biology : CB. 9, 579-587 (1999).
- Mandato, C. A., Bement, W. M. Contraction and polymerization cooperate to assemble and close actomyosin rings around Xenopus oocyte wounds. The Journal of cell biology. 154, 785-797 (2001).
- Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. The Journal of cell biology. 168, 429-439 (2005).
- Simon, C. M., Vaughan, E. M., Bement, W. M., Edelstein-Keshet, L. Pattern formation of Rho GTPases in single cell wound healing. Molecular biology of the cell. 24, 421-432 (2013).
- Petersen, C. C., Dupont, G. The initiation of a calcium signal in Xenopus oocytes. Cell calcium. 16, 391-403 (1994).
- Horisberger, J. D., Lemas, V., Kraehenbuhl, J. P., Rossier, B. C. Structure-function relationship of Na,K-ATPase. Annual review of physiology. 53, 565-584 (1991).
- Miledi, R. A calcium-dependent transient outward current in Xenopus laevis oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. , 491-497 (1982).
- Miledi, R., Parker, I. Chloride current induced by injection of calcium into Xenopus oocytes. The Journal of physiology. 357, 173-183 (1984).
- Parker, I., Miledi, R. A calcium-independent chloride current activated by hyperpolarization in Xenopus oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. 233, 191-199 (1988).
- Costa, P. F., Emilio, M. G., Fernandes, P. L., Ferreira, H. G., Ferreira, K. G. Determination of ionic permeability coefficients of the plasma membrane of Xenopus laevis oocytes under voltage clamp. The Journal of physiology. 413, 199-211 (1989).
- Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 385-397 (2012).
- Porterfield, D. M. Measuring metabolism and biophysical flux in the tissue, cellular and sub-cellular domains: recent developments in self-referencing amperometry for physiological sensing. Biosensors. 22, 1186-1196 (2007).
- McLamore, E. S., et al. A self-referencing glutamate biosensor for measuring real time neuronal glutamate flux. Journal of neuroscience methods. 189, 14-22 (2010).
- Yin, M., et al. Highly sensitive and fast responsive fiber-optic modal interferometric pH sensor based on polyelectrolyte complex and polyelectrolyte self-assembled nanocoating. Analytical and bioanalytical chemistry. 399, 3623-3631 (2011).
- Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrode technology for non-invasive real-time measurement of biophysical flux and physiological sensing. The Analyst. 134, 2224-2232 (2009).
- McLamore, E. S., Jaroch, D., Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrodes for measuring spatially resolved, real-time metabolic oxygen flux in plant systems. Planta. 232, 1087-1099 (2010).
- McLamore, E. S., et al. A self referencing platinum nanoparticle decorated enzyme-based microbiosensor for real time measurement of physiological glucose transport. Biosensors & bioelectronics. 26, 2237-2245 (2011).
