Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.
Celler fra dyr, planter og enkeltceller er omsluttet av en barriere som kalles cellemembran som skiller cytoplasma fra utsiden. Cellelag slik som epitel danner også en barriere som skiller det indre utenfra eller forskjellige avdelinger av flercellede organismer. Et viktig trekk ved disse barrierene er differensial fordeling av ioner over cellemembranen eller cellelagene. To eiendommer tillate denne fordelingen: 1) membraner og epithelia vise selektiv permeabilitet til spesifikke ioner; 2) ioner transporteres gjennom pumpene over cellemembranen og cellelagene. Disse egenskapene spille viktige roller i å opprettholde vev fysiologi og fungere som signaliserte signaler etter skade, under reparasjonen, eller under patologisk tilstand. Den ion-selektive selvreferanse microelectrode tillater målinger av spesifikke flukser av ioner slik som kalsium, kalium eller natrium ved enkeltcelle og vevsnivåer. Den microelectrode inneholder en ionofor cocktail som erselektivt gjennomtrengelig for et bestemt ion. Den indre fyllingsoppløsning inneholder et sett konsentrasjon av det ion av interesse. Det elektriske potensial til mikroelektroden bestemmes av utsiden konsentrasjonen av ionet. Som ione-konsentrasjonen varierer, potensialet i microelectrode forandrer seg som en funksjon av logaritmen av ioneaktivitet. Når den beveges frem og tilbake i nærheten av en kilde eller vask av det ion (dvs. i en konsentrasjonsgradient på grunn ionefluks) mikroelektroden potensialet svinger ved en amplitude som er proporsjonal med ionefluks / gradient. Forsterkeren forsterker microelectrode signalet og utgangssignalet er innspilt på maskinen. Den ionefluks kan da beregnes ved Ficks diffusjonslov ved hjelp av elektrodepotensialet svingning, ekskursjon til mikroelektroden, og andre parametere som for eksempel det spesifikke ion mobilitet. I denne artikkelen beskriver vi i detalj metodikken for å måle ekstracellulære ion flukser bruker ion-selektive selvreferanse microelectrode end presentere noen representative resultater.
Alle dyreceller er omgitt av et lipidbilag membran som separerer cytoplasma fra omgivelsene utenfor. Cellen opprettholder et elektrisk membranpotensiale, negative innsiden, ved aktiv transport av ioner 1. Membranen er en potensiell energikilde som er lagret i cellen kan bruke til å drive ulike molekylære enheter i membranen 2. Nevroner og andre hissige celler har store membranpotensialer. Hurtig åpning av natriumkanaler kollapser membranpotensialet (depolarisering) og produserer virkningspotensialet som transporteres langs lengden av neuron 2. Bortsett fra disse raske elektriske forandringer, mange vev og organer generere og opprettholde betydelige langsiktige elektriske potensialer. For eksempel, hud og hornhinnen epitel generere og vedlikeholde trans-epitelceller potensialer og ekstracellulære elektrisk strøm ved retnings pumping av ioner (hovedsakelig natrium og klorid) 3.
telt "> Mens målinger av endogene ekstracellulære elektrisk strøm ved hjelp av den vibrerende sonde 4-6 og målinger av membran eller trans-epitel potensialer ved hjelp av microelectrode systemet 7-10 tillater måling av de elektriske parametre av cellemembraner og epiteliale cellelag, gir de ingen angivelse av de ion-artene som er involvert.Mikroelektroder med selektiv ionofor kan måle spesifikke ion-konsentrasjonen i oppløsningen. Ion-gradienter eller flussmiddel kunne måles med to eller flere elektroder i forskjellige posisjoner. Imidlertid vil den iboende spenningen drift av hver sonde være forskjellig, noe som fører til unøyaktige målinger eller til påvisning av en gradient som ikke var til stede. En enkelt elektrode som brukes i "selvreferer" -modus hvor den beveger seg med lav frekvens mellom to punkter løser dette problemet. Nå er ionefluks kan sees på bakgrunn av en forholdsvis langsom og stabilt signal drift (se figur 3B). </p>
Den ion-sensitive målesystemet bruker ion-selektive selvreferanser mikroelektroder å oppdage små ekstracellulære fluks av ioner nær vev eller enkeltceller. Systemet består av en forsterker som behandler signalet fra mikroelektrode, og en mikro-stepper motor og driver for å styre bevegelsen til mikroelektroden. Den ion-selektive mikroelektroden og referanseelektroden som lukker kretsen er koblet til forsterkeren via en heads pre-forsterker (figur 1A). Datamaskinprogrammet bestemmer parametrene til mikroelektroden bevegelse (frekvens, avstand) og registrerer også utgangen fra forsterkeren. Trinnmotoren styrer microelectrode bevegelsen via en tredimensjonal micropositioner. En lavfrekvent vibrasjons ioneselektiv microelectrode ble først utviklet i 1990 for å måle spesifikk kalsiumflukssignal 11. Samt kalsium, kommersielt tilgjengelige ionofor cocktailer er nå tilgjengelig for å gjøre microelectrodes følsom for natrium, klorid, kalium, hydrogen, magnesium, nitrat, ammonium, fluorid, litium eller kvikksølv.
I utgangspunktet, omdanner selvreferanse ioneselektiv microelectrode teknikk aktiviteten til et bestemt ion oppløst i en løsning i et elektrisk potensial, noe som kan måles ved hjelp av et voltmeter. Ionoforen cocktail er en ikke-blandbare væsker (organisk, lipofile) fase med ion-exchange egenskaper. Ionoforen selektivt komplekser (binder) spesifikke ioner reversibelt og overfører dem mellom den vandige oppløsning inneholdt i mikroelektrode (elektrolytt) og den vandige oppløsning hvori mikroelektroden er neddykket (figur 1D). Dette ion overføring fører til en elektrokjemisk likevekt og en variant av det elektriske potensial mellom mikroelektroden og referanseelektroden måles av voltmeteret. Spenningen er proporsjonal med logaritmen av den spesifikke ion aktivitet i henhold til Nernst equation tillater beregning av ione-konsentrasjonen (figur 2A og B).
I dag flere systemer tillater måling av ionefluks ved hjelp av et lignende konsept og prinsipp. For eksempel skanne Ion-selektive elektrode Technique (siet) 12,13 eller microelectrode Ion Flux Estimering (mife) teknikk utviklet av Newman og Shabala 14-16 er kommersielt tilgjengelig og mye brukt av forskersamfunnet for å kunne fastslå bestemt ion belegg skjer på cellemembranen og vev på tvers av en rekke dyr, planter og enkelt levende cellemodeller. Ion-selektive mikroelektroder er blitt brukt til å måle hydrogen, kalium og kalsium-fluks på tvers av planterøttene 17, klorid flussmiddel i rottehjernearteriene 18 og i pollen rør 19, hydrogen fluks i skatenetthinneceller 20, kalsium fluks i mus ben 21, en rekke Ion flukser i soppens hyfer 22 og i rpå hornhinnen 23, og til slutt kalsium flux under enkelt celle sårtilheling 12,24. Se også følgende vurdering for detaljert informasjon om ion-selektive selvreferanser mikroelektroder 25.
Den følgende artikkelen beskriver i detalj hvordan du kan forberede og utføre måling av endogene ekstracellulære ion flukser bruker ion-selektive selvreferanse microelectrode teknikk på celle-nivå.
De mest kritiske trinn for vellykket måling av ekstracellulære ion flukser in vivo er: reduksjon av støy, er den riktige fremstillingen av ion-selektive mikroelektroder og referanseelektrode, og posisjoneringen av prøven og begge elektroder.
For å minimalisere støy, bør registreringssystemet være i en jordet (jordet) Faraday-bur, fortrinnsvis med et metall-toppet (vibrasjonsisolasjon) tabell som også er jordet. I tillegg bør mikroskopet understellet også være jordet. Kil…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by National Science Foundation grant MCB-0951199, and in part by the NIH grant EY01910, California Institute of Regenerative Medicine grants RB1-01417 and by the Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) grant SFRH/BD/87256/2012.
IonAmp | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
IonAmp32 | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
Headstage pre-amplifier | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | INA116 | BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
MicroStep Driver | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
Manual micropositioner | World Precision Instruments | Model KITE-R | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
Magnetic stand | World Precision Instruments | Model M10 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
Vibration isolation table | Newport Inc. | Model VW-3036-OPT-023040 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces | Newport Inc. | Model 360-90 | Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table |
Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel | Newport Inc. | 460PD-X | none |
Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel | Newport Inc. | 460A-XY | none |
Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament | World Precision Instruments | TW150-4 | none |
Electrode puller | Narishige | PC-10 | none |
Metal rack | Made in-house | none | Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel |
Oven | QL | Model 10 Lab Oven | none |
Silanization solution I | Sigma-Aldrich | 85126 | Hazardous, handle as recommended by provider |
Glass Petri dish; Pyrex | Fisher Scientific | 316060 | none |
Electrode/micropipette storage jar | World Precision Instruments | E215 | none |
Glass dessicator | Fisher Scientific | 08-595E | Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight. |
Plastic Pasteur pipette | Fisher Scientific | 11597722 | none |
Bunsen burner | Fisher Scientific | S97329 | none |
Microscope slide | Sigma-Aldrich | S8902 | none |
Straight microelectrode holder | Warner Instruments | QSW-A15P | with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire |
Straight microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH3S | with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector |
6 cm Petri dish | VWR | 60872-306 | none |
Nitex mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX750 | none |
Glue; Loctite epoxy | VWR | 500043-451 | Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing |
Deionized water | Sigma-Aldrich | 99053 | none |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | none |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | none |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | none |
Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | none |
Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | none |
Sodium Hydroxyde | Sigma-Aldrich | S8045 | none |
Potassium Acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | none |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | none |