فرخ القلب الغزو الفحص لاختبار الغازية من خلايا سرطان وآخر للمركبات يحتمل مكافحة الغازية
Summary
هنا، نقدم بروتوكول لدراسة غزو الخلايا السرطانية إلى أجزاء يعيشون الأنسجة الطبيعية في ثلاثة أبعاد. يتم تطبيق هذه التقنية الثقافة الجهاز أساسا لاختبار الأدوية محتملة مكافحة الغازية في المختبر.
Abstract
الهدف من الفحص الفرخ القلب هو تقديم طريقة ثقافة الأجهزة ذات الصلة لدراسة غزو الورم في ثلاثة أبعاد. الفحص يمكن التمييز بين الخلايا الغازية وغير الغازية، ويمكن دراسة آثار مركبات الاختبار على غزو الورم. الخلايا السرطانية – إما المجاميع أو خلايا مفردة – نواجه شظايا الجنينية الفرخ القلب. بعد ثقافة الجهاز في تعليق لبضعة أيام أو أسابيع قليلة يتم إصلاح الثقافات مواجهة وجزءا لا يتجزأ من البارافين للتحليل النسيجي. ثم يتم بناؤها التفاعل ثلاثي الأبعاد بين الخلايا السرطانية والأنسجة الطبيعية من مسلسل أقسام ملطخة الهيماتوكسيلين يوزين أو بعد تلطيخ المناعى للالحواتم في أنسجة القلب أو الخلايا السرطانية التي تواجه. الفحص يتسق مع مفهوم حديث أن غزو السرطان هو نتيجة التفاعلات الجزيئية بين الخلايا السرطانية وعناصرها المضيف انسجة المجاورة (myofibroblasts، endothخلايا elial، مكونات المصفوفة خارج الخلية، وما إلى ذلك). هنا، يتم تقديم هذه البيئة انسجة على الخلايا السرطانية مثل جزء الأنسجة الحية. دعم الجوانب لأهمية الفحص متعددة. الغزو في الاختبار هو وفقا للمعايير غزو السرطان: الاحتلال التدريجي والاستبدال في الزمان والمكان من النسيج المضيف، والغازية وغير الغازية في الجسم الحي من الخلايا التي تواجه يرتبط عموما مع نتائج الفحص. وعلاوة على ذلك، فإن نمط غزو الخلايا في الجسم الحي، كما تم تعريفها من قبل الأطباء، وينعكس في الصور النسيجية في الفحص. الكمي علاقة هيكل النشاط (QSAR) تحليل النتائج التي تم الحصول عليها مع العديد من المركبات العضوية يمكن أن تكون متجانسة مكافحة الغازية يسمح للدراسة العلاقات هيكل النشاط لمركبات الفلافونويد والجالكونات، والعقاقير المضادة للالمتنقل المعروف المستخدمة في العيادة (على سبيل المثال، مثبطات أنيبيب ) تمنع الغزو في مقايسة كذلك. Howeveص، وفحص لا يأخذ بعين الاعتبار مساهمات المناعية للغزو السرطان.
Introduction
الغزو هو السمة المميزة للأورام الخبيثة. هذا النشاط لا يؤدي فقط إلى تدمير الأنسجة المحيطة بها، ولكن تورط أيضا في تشكيل ورم خبيث. منذ مرضى السرطان يموتون من الغزو وورم خبيث، وكفاءة العلاجات المضادة للالغازية لا تزال شحيحة، فحوصات المخبرية التي تحاكي وقد وضعت غزو الخلايا السرطانية. الهدف من الفحص الفرخ القلب هو تقديم طريقة ثقافة الأجهزة ذات الصلة لدراسة غزو الورم في ثلاثة أبعاد. الفحص يمكن التمييز بين الخلايا الغازية وغير الغازية، ويسمح لدراسة آثار مركبات الاختبار على غزو الورم.
الأساس المنطقي وراء استخدام الاختبار هو مفهوم الفعلي الذي الأورام النظم الإيكولوجية التي الخلايا الورمية تتفاعل باستمرار مع سدى بها (الخلايا المضيفة والمصفوفة خارج الخلية)، وذلك من خلال هذه التفاعلات الجزيئية الغزو على ما يرام ضبطها 1. لذلك، في فحص تواجه الخلايا السرطانية مع تلفزيون القناة الاولىنانوغرام الجنينية شظايا الفرخ القلب 2، التي تخدم ليس فقط باعتبارها ركائز للغزو من قبل خلايا الورم، ولكن أيضا كمصدر من أنواع مختلفة من الخلايا اللحمية وعناصر المصفوفة. قلب كتكوت يحتوي myocytes، الخلايا الليفية والخلايا البطانية، وتتكون المصفوفة خارج الخلية من laminin، فبرونيكتين وأنواع مختلفة من الكولاجين. في هذه الطريقة، تغطي ثلاثية الأبعاد تقنية ثقافة الجهاز كثير من التفاعلات الخلوية والجزيئية المتورطين في غزو أورام المرضى.
والميزة الرئيسية للمقايسة الفرخ القلب هو تنفيذ الآثار اللحمية. هذا الجانب هو أكثر اكتمالا مما كان عليه في المقايسات الغزو أخرى في المختبر التي تستند إلى غزو الخلايا السرطانية في المواد الهلامية غير الحية تتألف من الغشاء القاعدي 3 أو مصفوفة الخلالي 4 الجزيئات. وقد تم إدخال مفهوم المواجهة بين الخلايا السرطانية والطبيعية الأنسجة الحية المضيفة كما هو موجود في الثقافة الجهاز التجريب من قبل عدةالكتاب بما في ذلك وولف وشنايدر في فرنسا 5، Easty وEasty في المملكة المتحدة 6، وSCHLEICH في ألمانيا 7. اثنين من المزايا التقنية للغزو فحص الفرخ القلب على الطرق المذكورة هي أن حجم شظايا يمكن بسهولة موحدة، وأنها لا تزال مقلص، والذي يسمح مراقبة سلامة وظيفية خلال الثقافة الجهاز. وعلاوة على ذلك، ويفضل أجنة الطيور، لأنها يمكن بسهولة أن تشريح من محتوى العقيمة من البيض. مقايسة لديه تشابه المفاهيمي لفرخ السقاء المشيمائي غشاء فحص 8 من خلال تقديم انسجة المعقدة المحيطة إلى الخلايا السرطانية.
وقد تم بنجاح تطبيق فحص للتمييز بين المتغيرات الخلايا الغازية وغير الغازية من نفس الأورام البشرية كما هو الحال في MCF-7 (الثدي) 9 وHCT-8 (القولون) 10 عائلات خط الخلية. هذه التقنية مفيدة لاختبار مركبات يحتمل أن تكون معادية للالغازية وكذلك <suP> 11،12. كما أوضح كذلك، فإنه يمكن استخدامها لإقامة علاقات هيكل النشاط من الجزيئات العضوية الصغيرة. مقايسة لا، ومع ذلك، لا تأخذ بعين الاعتبار مساهمة الخلايا المناعية لغزو السرطان. وينبغي التأكيد على أن هذه التقنية لا يمكن اعتبار نظام تحليل الإنتاجية العالية، نظرا لوجود عدد كبير من التلاعب، وأعداد محدودة من أشواط فحص (الحد الأقصى 30 الثقافات) ودورانها وقت طويل (حوالي 1 شهر).
Protocol
Representative Results
Discussion
أثناء إعداد PHFs، وشظايا قد لا يبقى في التعليق لكن التمسك جدار الوعاء الدموي. يمكن التغلب على ذلك عن طريق زيادة حجم مستنبت. إذا كان عدد PHFs منخفض جدا وحجمها كبير جدا، وانخفاض حجم مستنبت. قد يكون راجعا إلى التقلبات في درجة الحرارة أو العدوى الميكروبية فشل الخلايا اختبار ل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Marleen De Meulemeester for demonstrating the assay technique in the video film. B. I. R. is a Postdoctoral Research Fellow of the Research Foundation – Flanders (FWO – Vlaanderen). L.M.M. is a recipient of an Emmanuel van der Schueren grant from the Flemish League against Cancer (Vlaamse Liga tegen Kanker).
Materials
| Ringer's salt solution | Braun | CEO123 | |
| Bacto-agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethaan Analar | VWR | 103157P | |
| BSA : albumin from bovine serum, cohn V fract. | Sigma | A4503-500G | |
| MEM-Rega 3 | Life Technologies | 19993013 | |
| Gyrotory shakers | New Brunswick Scientific | G10 and G33 | |
| Erlenmeyer flasks 50 ml | Novolab | 92717 | |
| Glass Petri dishes | Novolab | 68516 | |
| Iridectomy scissors | Rumex | 11-0625 | |
| Macroscope with calibrated ocular grid | Wild | 157702 | |
| Paraffin wax | International Medical products | 8599956 | |
| Eosin Y | Sigma | 230251-25g | |
| Harris' hematoxylin | Sigma | HHS32-1L | |
| Coverslipping resin (Tissue-Tek) | Sakura | 4494 | |
| Paraffin melting apparatus | GFL | 1052 | |
| Microtome for paraffin sectioning | Reichert | ||
| Stppers for Erlemeyer flasks with gas in- and outlets | Novolab | 2602421 and 260243 | |
| Diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| REAX rocking table | Heidolph | 54131 | |
| 24-well tissue dishes | VWR | NUNC142475 | |
| Ophtalmological enucleation spoon | Rumex | 16-060 | |
| Sharp forceps | Rumex | 4-111T | |
| Blunt forceps | Nickel-Electro LTD | 7112 | |
| Erlenmeyer flasks 5 ml | Novolab | 211901 | |
| Microscope slides washed and degreased | International Medical products | 8613908 |
References
- Mareel, M. M., Bracke, M. E., Van Roy, F. M., de Baetselier, P., JR, B. e. r. t. i. n. o. Molecular mechanisms of cancer invasion. Encyclopedia of Cancer. 2, 1072-1083 (1997).
- Mareel, M., Kint, J., Meyvisch, C. Methods of study of the invasion of malignant C3H mouse fibroblasts into embryonic chick heart in vitro. Virchows Arch. B. Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol. 30 (1), 95-111 (1979).
- Albini, A., Noonan, D. M. The ‘chemoinvasion’ assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis. Curr. Opin. Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).
- De Wever, O., et al. Single cell and spheroid collagen type I invasion assay. Methods Mol. Biol. 1070, 12-35 (2014).
- Wolff, E., Schneider, N. La transplantation prolongée d’un sarcome de souris sur des organes embryonnaires de poulet cultivés in vitro. C.R. Seances Soc. Biol. Fil. 151 (7), 1291-1292 (1957).
- Easty, G. C., Easty, D. M. An organ culture system for the examination of tumor invasion. Nature. 199, 1104-1105 (1963).
- Schleich, A. B., Frick, M., Mayer, A. Patterns of invasive growth in vitro. Human decidua graviditatis confronted with established human cell lines and primary human explants. J. Natl. Cancer Inst. 56 (2), 221-237 (1976).
- Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a Xenograftodel for Sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522 (2013).
- Bracke, M. E., Van Larebeke, N. A., Vyncke, B. M., Mareel, M. M. Retinoic acid modulates both invasion and plasma membrane ruffling of MCF-7 human mammary carcinoma cells in vitro. Br. J. Cancer. 63 (6), 867-872 (1991).
- Vermeulen, S. J., et al. Transition from the noninvasive to the invasive phenotype and loss of alpha-catenin in human colon cancer cells. Cancer Res. 55 (20), 4722-4728 (1995).
- Parmar, V. S., et al. Anti-invasive activity of 3,7-dimethoxyflavone in vitro. J. Pharma. Sci. 83 (9), 1217-1221 (1994).
- Parmar, V. S., et al. Anti-invasive activity of alkaloids and polyphenolics in vitro. Bioorg. Med. Chem. 5 (8), 1609-1619 (1997).
- Gaillard, P. J., MB, V. i. s. s. e. r. Organ culture technique using embryologic watch glasses. Methods in Medical Research. 2, 241-24 (1951).
- Romeis, B. Das mikrotom. Mikroskopische Technik. 15 Verb. Aufl. Kapitel. 7, 114-120 (1948).
- Van Marck, V., et al. P-cadherin promotes cell-cell adhesion and counteracts invasion in human melanoma. Cancer Res. 65 (19), 8774-8783 (2005).
- Attia, M. A., Weiss, D. W. Immunology of spontaneous mammary carcinomas in mice. V. Acquired tumor resistance and enhancement in strain A mice infected with mammary tumor virus. Cancer Res. 26 (8), 1787-1800 (1966).
- Katritzky, A. R., et al. QSAR modeling of anti-invasive activity of organic compounds using structural descriptors. Bioorg. Med. Chem. 14 (20), 6933-6939 (2006).
- McKinnell, R. G., Bruyneel, E. A., Mareel, M. M., Seppanen, E. D., Mekala, P. R. Invasion in vitro by explants of Lucke renal carcinoma cocultered with normal tissue is temperature dependent. Clin. Exp. Metastasis. 4 (4), 237-243 (1986).
- Wanson, J. C., de Ridder, L., Mosselmans, R. Invasion of hyperplastic nodule cells from diethylnitrosamine treated cells. Cancer Res. 41 (12 Pt 1), 5162-5175 (1981).
- Mareel, M. M., et al. Effect of temperature on invasion of MO4 mouse fibrosarcoma cells in organ culture. Clin. Exp. Metastasis. 2 (2), 107-125 (1984).
- Laerum, O. D., Steinsvag, S., Bjerkvig, R. Cell and tissue culture of the central nervous system: recent developments and current applications. Acta Neurol. Scand. 72 (6), 529-549 (1985).
- Schroyens, W., Mareel, M. M., Dragonetti, C. In vitro invasiveness of human bladder cancer from cell lines and biopsy specimens. Clin. Exp. Metastasis. 1 (2), 153-162 (1983).
- Mareel, M. M., De Bruyne, G. K., Vandesande, F., Dragonetti, C. Immunohistochemical study of embryonic chick heart invaded by malignant cells in three dimensional culture. Invasion Metastasis. 1 (3), 195-204 (1981).
- Bjerkvig, R., Laerum, O. D., Mella, O. Glioma cell interactions with fetal rat brain aggregates in vitro and with brain tissue in vivo. Cancer Res. 46 (8), 4071-4079 (1986).
- Bracke, M. E., et al. Confrontation of an invasive (MO4) and a non-invasive (MDCK) cell line with embryonic chick heart fragments in serum-free culture media. In Vitro Cell Dev. Biol. 22 (9), 508-514 (1986).
- Mareel, M. M., Bracke, M. E., Storme, G. A., Grundmann, E. Mechanisms of tumor spread: a brief overview. Cancer Campaign. 9: The Cancer Patient. , 59-64 (1985).
- De Neve, W. J., Storme, G. A., De Bruyne, G. K., Mareel, M. M. An image analysis system for the quantification of invasion in vitro. Clin. Exp. Metast. 3 (2), 87-101 (1985).
- Smolle, J., et al. Quantitative evaluation of melanoma cell invasion in three-dimensional confrontation cultures in vitro using automated image analysis. J. Invest. Dermatol. 94 (1), 114-119 (1990).
- Bracke, M. E., et al. flavonoid effect on tumor invasion and metastasis. Food Technol. 48 (11), 121-124 (1994).
- Bracke, M. E., et al. The influence of tangeretin on tamoxifen’s therapeutic benefit in mammary cancer. J. Natl. Cancer Inst. 91 (4), 354-359 (1999).
