Summary

Chick Coeur Invasion Assay pour tester les techniques invasives des cellules cancéreuses et l'activité des composés potentiellement anti-invasives

Published: June 06, 2015
doi:

Summary

Ici, nous présentons un protocole d'étudier l'invasion des cellules tumorales dans des fragments de tissus normaux vivant en trois dimensions. Cette technique de culture d'organe est principalement appliqué pour tester des médicaments potentiellement anti-invasif in vitro.

Abstract

L'objectif de l'essai de coeur de poulet est de proposer une méthode de culture d'organes pertinents pour étudier l'invasion tumorale en trois dimensions. L'essai peut distinguer entre les cellules invasives et non invasives, et qui permet l'étude des effets des composés d'essai sur l'invasion tumorale. Les cellules cancéreuses – soit comme des agrégats ou des cellules individuelles – sont confrontés à des fragments de coeur de poussin embryonnaire. Après culture d'organes en suspension pendant quelques jours ou quelques semaines, les cultures sont fixées et auxquels sont confrontés noyés dans de la paraffine pour une analyse histologique. L'interaction à trois dimensions entre les cellules cancéreuses et les tissus normaux est ensuite reconstruit à partir de coupes sériées colorées à l'hématoxyline-éosine ou après coloration immunohistochimique pour des epitopes dans le tissu cardiaque ou les cellules cancéreuses se posent. L'analyse est compatible avec la notion que récente invasion du cancer est le résultat d'interactions moléculaires entre les cellules cancéreuses et leurs éléments d'accueil du stroma voisin (myofibroblastes, endothElial cellules, des composants de la matrice extracellulaire, etc.). Ici, cet environnement stromal est offerte aux cellules cancéreuses en tant que fragment de tissu vivant. Aspects de soutien à la pertinence de l'essai sont multiples. Invasion dans le dosage est en conformité avec les critères de l'invasion du cancer: l'occupation et le remplacement progressif dans le temps et l'espace du tissu hôte, et le caractère invasif et non invasif in vivo des cellules se posent généralement corrélée avec les résultats de l'essai. En outre, le motif de l'invasion des cellules in vivo, tel que défini par les pathologistes, se reflète dans les images histologiques dans le dosage. Quantitative relation structure-activité (QSAR) l'analyse des résultats obtenus avec de nombreux composés potentiellement anti-invasives congénères organiques a permis l'étude des relations structure-activité pour les flavonoïdes et les chalcones, et les médicaments anti-métastatiques connus utilisés dans la clinique (par exemple, les inhibiteurs des microtubules ) inhibent l'invasion dans le dosage ainsi. However, l'analyse ne tient pas compte des contributions immunologiques à l'invasion du cancer.

Introduction

Invasion est la marque de tumeurs malignes. Cette activité conduit non seulement à la destruction des tissus environnants, mais est également impliquée dans la formation de métastases. Étant donné que les patients cancéreux meurent de l'invasion et la métastase, et les traitements anti-invasives sont encore efficaces, des essais de laboratoire rares qui imitent l'invasion de cellules tumorales ont été développés. L'objectif de l'essai de coeur de poulet est de proposer une méthode de culture d'organes pertinents pour étudier l'invasion tumorale en trois dimensions. L'essai peut distinguer entre les cellules invasives et non invasives, et permet d'étudier les effets des composés d'essai sur l'invasion tumorale.

La raison derrière l'utilisation de l'essai est le concept même que les tumeurs sont des écosystèmes où les cellules néoplasiques interagissent en permanence avec leur stroma (cellules hôtes et la matrice extracellulaire), et que, grâce à ces interactions moléculaires invasion est affiné 1. Ainsi, dans le test des cellules tumorales sont confrontés à livifragments embryonnaires de poussin cardiaques ng deux, qui servent non seulement en tant que substrats pour l'invasion par les cellules tumorales, mais également en tant que source de différents types de cellules stromales et les éléments de matrice. Le cœur de poussin contient les myocytes, les fibroblastes et les cellules endothéliales et la matrice extracellulaire est constituée de la laminine, la fibronectine et les différents types de collagène. De cette façon, la technique de culture d'organe tridimensionnel couvre de nombreuses interactions cellulaires et moléculaires impliqués dans l'invasion des tumeurs de patients.

Le principal avantage de l'essai de coeur de poulet est la mise en œuvre des effets stromales. Cet aspect est plus complète que dans les autres essais d'invasion in vitro qui sont basés sur l'invasion des cellules tumorales dans des gels non vivants constitués de membrane basale trois ou quatre matrice interstitielle des molécules. Le concept de la confrontation entre les cellules tumorales et les tissus de l'hôte de la vie normale que l'on trouve dans la culture d'organes expérimentation a été introduite par plusieursauteurs y compris Wolff et Schneider en France 5, Easty et Easty au Royaume-Uni 6 et 7 Schleich en Allemagne. Deux avantages techniques de l'invasion dosage de coeur de poulet sur les méthodes citées est que le volume des fragments peut facilement être normalisé, et qu'ils restent contractile, qui permet la surveillance de l'intégrité fonctionnelle pendant la culture d'organes. En outre, les embryons aviaires sont préférés, car ils peuvent être facilement disséquées à partir du contenu stérile de l'œuf. L'essai a ressemblance conceptuelle pour le poussin chorio-allantoïde membrane dosage 8 en offrant un stroma complexe environnante pour les cellules tumorales.

L'essai a été appliquée avec succès à la distinction entre les variants de cellules invasives et non invasives des mêmes tumeurs humaines comme dans la MCF-7 (mammaire) 9 et HCT-8 (côlon) 10 familles de lignée cellulaire. La technique est utile pour tester des composés potentiellement anti-invasives ainsi <sup> 11,12. Comme expliqué plus loin, il peut être utilisé pour l'établissement de relations structure-activité des petites molécules organiques. L'essai ne cependant pas tenir compte de la contribution des cellules immunologiques à l'invasion du cancer. Il convient de souligner que la technique ne peut pas être considéré comme un système d'analyse à haut débit, en raison du nombre élevé de manipulations, le nombre limité de séries de dosage (maximum 30 cultures) et le long temps de demi-tour (environ 1 mois).

Protocol

Figure 1. Présentation schématique des différentes étapes de l'analyse. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. 1. Préparation de fragments de coeur précultivées (PHF) Incuber un oeuf fécondé de poussin à 3…

Representative Results

Les coupes histologiques telles que présentées dans la figure 5 montrent le résultat d'un certain nombre de tests réussis d'extrémité. L'histologie bruit des cultures indique cellules viables et permet d'interpréter l'interaction entre les cellules tumorales et des tissus normaux. En outre, aucune réaction immunitaire du tissu normal peut être observée, ce qui confirme que l'âge exact des embryons de poulet utilisés, par exemple, avant que le système de rejet immunitaire est…

Discussion

Pendant la préparation de PHF, les fragments ne peuvent pas rester en suspension, mais adhérer à la paroi de la cuve; cela peut être surmonté en augmentant le volume du milieu de culture. Si le nombre de PHF est trop faible et leur taille est trop grande, diminuer le volume du milieu de culture. La défaillance des cellules de test pour agréger peut être due aux fluctuations de la température ou à une infection microbienne. En variante, une incapacité à se regrouper peut être une caractéristique intrinsèqu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Marleen De Meulemeester for demonstrating the assay technique in the video film. B. I. R. is a Postdoctoral Research Fellow of the Research Foundation – Flanders (FWO – Vlaanderen). L.M.M. is a recipient of an Emmanuel van der Schueren grant from the Flemish League against Cancer (Vlaamse Liga tegen Kanker).

Materials

Ringer's salt solution Braun CEO123
Bacto-agar Becton Dickinson 214010
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethaan Analar VWR 103157P
BSA : albumin from bovine serum, cohn V fract. Sigma A4503-500G
MEM-Rega 3 Life Technologies  19993013
Gyrotory shakers New Brunswick Scientific G10 and G33
Erlenmeyer flasks 50 ml Novolab 92717
Glass Petri dishes Novolab 68516
Iridectomy scissors Rumex 11-0625
Macroscope with calibrated ocular grid Wild 157702
Paraffin wax International Medical products 8599956
Eosin Y Sigma 230251-25g
Harris' hematoxylin Sigma HHS32-1L
Coverslipping resin (Tissue-Tek) Sakura 4494
Paraffin melting apparatus GFL 1052
Microtome for paraffin sectioning Reichert
Stppers for Erlemeyer flasks with gas in- and outlets Novolab 2602421 and 260243
Diaminobenzidine Sigma D8001
REAX rocking table Heidolph 54131
24-well tissue dishes VWR NUNC142475
Ophtalmological enucleation spoon Rumex 16-060
Sharp forceps Rumex 4-111T
Blunt forceps Nickel-Electro LTD 7112
Erlenmeyer flasks 5 ml Novolab 211901
Microscope slides washed and degreased International Medical products 8613908

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Bracke, M. E., Roman, B. I., Stevens, C. V., Mus, L. M., Parmar, V. S., De Wever, O., Mareel, M. M. Chick Heart Invasion Assay for Testing the Invasiveness of Cancer Cells and the Activity of Potentially Anti-invasive Compounds. J. Vis. Exp. (100), e52792, doi:10.3791/52792 (2015).

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