Påvisning af Axonally Lokaliseret mRNA i Brain Sektioner Brug High-Resolution<em> In Situ</em> Hybridisering
Summary
RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.
Abstract
mRNA ofte lokaliseret til hvirveldyr axoner og deres lokale oversættelse er nødvendig for axon stifinding eller forgrening under udvikling og for vedligeholdelse, reparation eller neurodegeneration i postdevelopmental perioder. Høje throughput analyser har for nylig afsløret, at axoner har en mere dynamisk og kompleks transkriptom end tidligere forventet. Disse analyser er imidlertid blevet det meste gjort i dyrkede neuroner, hvor axoner kan isoleres fra somatisk-dendritiske rum. Det er næsten umuligt at opnå en sådan isolation i hele væv in vivo. Således, for at verificere rekrutteringen af mRNA og deres funktionelle relevans i et helt dyr, transkriptom analyser bør ideelt kombineres med teknikker, der tillader visualisering af mRNA in situ. For nylig er hidtil ukendte ISH teknologier, der registrerer RNA'er på et enkeltstrenget molekyle niveau blevet udviklet. Dette er især vigtigt, når man analyserer den subcellulære lokalisering af mRNADa lokaliserede RNA'er findes typisk i lave niveauer. Her beskriver vi to protokoller til påvisning af axonally-lokaliserede mRNA'er under anvendelse af en hidtil ukendt ultrasensitiv RNA ISH-teknologi. Vi har kombineret RNAscope ISH med axonal modfarve anvendelse af fluorescens immunohistokemi eller histologiske farvestoffer til at verificere rekrutteringen af Atf4 mRNA til axoner in vivo i det modne murine og humane hjerner.
Introduction
Axonal mRNA rekruttering og lokalt oversættelse muliggøre axoner til at reagere på ekstracellulære stimuli i en tidsmæssigt og rumligt akut måde 1. Intra-axonal proteinsyntese forstås bedst i sammenhæng med nervesystemets udvikling hvor det spiller afgørende roller i vækst kegle adfærd 2-8, axon pathfinding 9-11 og retrograd signalering 12,13. Men langt mindre om den funktionelle betydning af axonal proteinsyntese i post-udviklingsmæssige neuroner når axonal mRNA og ribosom niveauer er stærkt reduceret 14,15. Modne hvirveldyr axoner har længe været anset for at være translatorisk inaktiv 16. Seneste undersøgelser viser dog, at den lokale oversættelse reaktiveret i modne axoner under patologiske tilstande. For eksempel er en delmængde af mRNA'er rekrutteret til regenererende axoner efter nervebeskadigelse og intra-axonal proteinsyntese er nødvendige til korrekt regenerering af disse axoner 17. Derudover vores gruppe has viste, at specifikke mRNA'er rekrutteres til axoner efter lokal eksponering for Alzheimers sygdom peptid Ap 1-42, og lokalt oversættelse af transkriptionsfaktoren ATF4 er påkrævet for at udbrede de neurodegenerative virkninger af Ap 1-42 fra axoner til den neuronale soma 18. Endelig har højt gennemløb analyser afslørede, at modne axoner har en mere kompleks og dynamisk transkriptom end forventet 18-21, især under patologiske tilstande. I lyset af disse undersøgelser, at en meget følsom og specifik metode registrerer axonally lokaliserede mRNA i voksne nervesystem er nødvendig.
Meget af arbejdet på mRNA rekruttering og lokalt oversættelse i modne axoner er blevet udført på dyrkede neuroner. Dette gælder især for transkriptom analyser siden specialiserede dyrkningsmetoder findes, der tillader isolering af axoner fra somato-dendritiske rum 18-20. Selv om sådanne undersøgelser har givet værdifulde insight ind i rollen som lokal oversættelse i modne axoner, hvorvidt dyrkede neuroner korrekt billede af den situation, in vivo, eller hvis mRNA rekruttering er en adaptiv reaktion axoner til dyrkningsbetingelser er stadig åben. Kun få studier har fremlagt dokumentation af mRNA rekruttering til modne axoner in vivo. For eksempel har transkriptet koder for det olfaktoriske markørprotein blevet detekteret i axoner hos voksne sensoriske neuroner 22. Et transgen indeholdende 3'UTR af β-actin-mRNA transporteres til axoner i perifere og centralnervesystemet neuroner i mus og er lokalt oversat efter udviklingsmæssige perioder 23. Lamin b2 mRNA er lokaliseret til retinale axoner i Xenopues laevis haletudser og udtynding påvirker Axon vedligeholdelse efter axonal udvikling 21. Interferens med axonal transport af mRNA koder for cytochrom C oxidase IV ændrer mus adfærd 24. Endelig Atf4 mRNA findes i voksen enXON'er af mus og humane hjerner i forbindelse med Ap 1-42-induceret neurodegeneration 18.
High throughput transkriptom analyser har vist sig at være nyttigt at identificere mRNA profiler i isolerede axoner in vitro, men har begrænsninger for in vivo-undersøgelser siden i hele væv axoner er aldrig fundet isoleret, men blandet med neuronale celle organer, gliaceller og andre celletyper. Således sådanne analyser skal kombineres med billeddannelsesteknikker, der bekræfter den subcellulære lokalisering af mRNA'er. RNA in situ hybridisering (RNA ISH) muliggør påvisning og visualisering af specifikke RNA-sekvenser i celler og væv. Men originale RNA ISH-assays var kun egnet til identifikation af stærkt rigelige RNA'er 25, hvilket sjældent er tilfældet for axonally lokaliserede mRNA. I de sidste årtier stigende indsats har været lagt i udviklingslandene nye teknologier, som gør påvisning af mRNA på enkelt-molekyle-niveau <sup> 25,26. For eksempel har Singer og kolleger udviklet ISH sonder til at opdage mRNA i enkelte celler, som består i 5 ikke-overlappende fluorescens-mærket 50-mer (for detaljer se 27). Den væsentligste forskel mellem de ovenfor nævnte teknikker og den her beskrevne, er, at den senere bruger 20 dobbelt Z-struktur (ikke lineær) prober, der typisk er målrettet ~ 1 kb region af RNA'et af interesse at sikre specificitet og lave baggrundsniveauer. Prober hybridiseres derefter med forforstærker og forstærker sekvenser, der er endelig fluorescensmærkede eller konjugeret med enzymer, der tillader chromogene reaktioner. Disse amplifikationstrinnene forbedre signal-til-støj-forhold sammenlignet med andre teknologier ISH 28. Her beskriver vi to protokoller anvender RNAscope kombineret enten med fluorescens immuncytokemi eller histologiske farvestoffer tillader axonal kontrastfarvning. Begge protokoller er egnede til at visualisere axonal lokalisering af Atf4 mRNA i voksne mobruge og menneskelige hjerne.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne rapport beskriver vi anvendelse af en høj opløsning ISH teknologi til detektion af axonally lokaliseret Atf4 mRNA. Disse og tidligere publicerede undersøgelser viser, at denne teknologi er kompatibel med antistof-baserede protein detektion i væv eller endda hele embryoner 33. Vigtigere er det, har det været for nylig anvendt til påvisning af Arc mRNA inden dendritter af hippocampusneuroner 34. Det kan også kombineres med histologiske farvestoffer til farvning af væ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Alzheimer’s Association (NIRG-10-171721; to U.H.), National Institute of Mental Health (MH096702; to U.H.), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS081333; to C.M.T.), and pilot study awards from the National Institute on Aging-funded Alzheimer’s Disease Research Center at Columbia University (AG008702; to J.B. and Y.Y.J.) that also supports the New York Brain Bank. We thank members of the Hengst laboratory for comments and discussions
Materials
| custom probe targeting residues 20-1381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716) | Advanced Cell Diagnostics | – | probe |
| custom probe targeting residues 15-1256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2) | Advanced Cell Diagnostics | – | probe |
| negative control probe-DapB | Advanced Cell Diagnostics | 310043 | probe |
| positive control probe-mouse Polr2A (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 312471 | probe |
| positive control probe-human PPIB (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 313901 | probe |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection) | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | In situ hybridization kit |
| RNAscope 2.0 HD Reagent Kit – BROWN (for chromogenic detection) | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | In situ hybridization kit |
| Goat polyclonal anti-ChAT antibody | Millipore | AB144P | |
| Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit | American MasterTech | KTLFB | |
| Clearify clearing agent (xylene substitute) | American MasterTech | CACLEGAL | |
| ProLong Gold mounting medium with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| DPX mounting medium | Sigma | 6522 |
References
- Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair. Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).
- Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32, 1013-1026 (2001).
- Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436, 1020-1024 (2005).
- Piper, M., et al. Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones. Neuron. 49, 215-228 (2006).
- Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. An essential role for β-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance. Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).
- Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).
- Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth. Nat. Commun. 5, 3506 (2014).
- Preitner, N., et al. APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly. Cell. 158, 368-382 (2014).
- Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target. Cell. 110, 223-235 (2002).
- Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation. Cell. 141, 632-644 (2010).
- Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay. Cell. 153, 1252-1265 (2013).
- Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).
- Ji, S. J., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification. Neuron. 74, 95-107 (2012).
- Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons. Neuron. 12, 571-582 (1994).
- Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).
- Hengst, U., Jaffrey, S. R. Function and translational regulation of mRNA in developing axons. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).
- Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome. Open Biology. 2, 120079 (2012).
- Baleriola, J., et al. Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions. Cell. 158, 1159-1172 (2014).
- Gumy, L. F., et al. Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization. RNA. 17, 85-98 (2011).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
- Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
- Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons. J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).
- Willis, D. E., et al. Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons. J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).
- Kar, A. N., et al. Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse. Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).
- Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).
- Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique. J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).
- Wang, H., et al. Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope. Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. . Theory and Practice of Histotechnology. , (1987).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biol. 12, 55 (2014).
- Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. . Theory and practice of histotechnology. , (1980).
