RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.
мРНК часто локализуется в позвоночных аксонов и их местный перевод требуется для поиска пути аксонов или разветвления в процессе разработки и технического обслуживания, ремонта или нейродегенеративных в postdevelopmental периодов. Высокие анализы пропускная недавно показали, что аксоны имеют более динамичное и сложное транскриптом, чем ожидалось ранее. Это анализ, однако, были в основном делается в культивируемых нейронах, где аксоны могут быть изолированы от сомато-дендритной отсеков. Это практически невозможно добиться такой изоляции в целых тканей в естественных условиях. Таким образом, для того, чтобы проверить набор мРНК и их функциональной значимости в целом животном, транскриптом анализ в идеале должны быть объединены с методами, которые позволяют визуализировать мРНК на месте. Недавно новые технологии ISH, которые обнаруживают РНК на уровне в одной молекулы были разработаны. Это особенно важно при анализе внутриклеточную локализацию мРНК, Так как локализованные РНК обычно находятся на низком уровне. Здесь мы описываем два протокола для обнаружения axonally-локализованных мРНК с использованием нового сверхчувствительного технологии РНК ISH. Мы объединили RNAscope ISH с аксонов контрастирующая с помощью флуоресцентной иммуногистохимии или гистологических красителей для проверки набор Atf4 мРНК для аксонов в естественных условиях в зрелом мозге мыши и человека.
Аксонов набор мРНК и локальная перевод позволяют аксоны в ответ на внеклеточные стимулы в времени и пространстве острой манере 1. Intra-аксонов синтез белка лучше понимать в контексте развития нервной системы, где она играет решающую роль в росте поведения конуса 2-8, 9-11 аксона первопрохождения и ретроградной сигнализации 12,13. Но гораздо меньше известно о функциональном значении аксонов синтеза белка в нейронах после развития, когда аксонов мРНК и рибосом уровни значительно снижается 14,15. Зрелые позвоночных аксоны уже давно считается неактивным поступательно 16. Тем не менее, последние исследования показывают, что местное перевод активируется в зрелых аксонов при патологических условиях. Например, подмножество мРНК рекрутируется регенерации аксонов после травмы нерва и внутри аксонов синтез белка требуется для правильной регенерации аксонов этих 17. Кроме того, наша группа гас показали, что специфические мРНК набираются аксонов после локальное воздействие на заболевания пептида Альцгеймера Ар 1-42, и местного перевод фактора транскрипции ATF4 требуется для распространения нейродегенеративных последствий Ар 1-42 из аксонов нейронов сомы 18. Наконец, высокие анализы пропускная показали, что зрелые аксоны имеют более сложную и динамичную транскриптом, чем ожидалось 18-21, особенно при патологических состояниях. В свете этих исследований, высокую чувствительность и специфичность метода для выявления axonally локализованные мРНК в нервной системе взрослых не требуется.
Большая часть работы по набору мРНК и местного перевод в зрелых аксонов была выполнена на культивируемых нейронов. Это особенно верно для транскриптомный анализирует с специализированные методы культивирования, которые позволили изоляции аксонов от сомато-дендритной отсека 18-20. Хотя такие исследования дали ценные модулиIGHT в роли местного перевод в зрелых аксонов, вопрос о том, культивируемые нейроны добросовестно представлять ситуацию в естественных условиях, или если мРНК вербовка адаптивная реакция аксонов культивирования условиях остается открытым. Несколько исследований предоставили доказательства вербовки мРНК, чтобы созреть аксоны в естественных условиях. Например, транскрипт кодирующей обонятельной маркерного белка был обнаружен в аксонов в сенсорных нейронах взрослых 22. Трансген, содержащий 3 'UTR из β-актина мРНК транспортируется аксонов периферических и центральных нейронов нервной системы у мышей и локально переводится после развития периодов 23. Ламин b2 мРНК локализуется сетчатки аксонов в Xenopues Laevis головастиков и его истощение влияет обслуживание аксонов после аксонов развития 21. Вмешательство в аксонов транспорта мРНК, кодирующей для цитохром с оксидазы IV изменяет поведение мыши 24. Наконец, Atf4 мРНК находится во взрослой аXons мышей и человеческих мозгов в контексте Ар 1-42 индуцированной нейродегенерации 18.
Высокая пропускная способность анализа транскриптом оказались полезными для идентификации мРНК профили в изолированных аксонов в пробирке, но есть ограничения для естественных условиях исследования в так целыми тканей аксоны никогда не встречаются в изоляции, а перемешаны с нейронных клеточных тел, глиальные клетки и другие типы клеток. Таким образом, такой анализ должен быть объединен с методик визуализации, которые подтверждают внутриклеточную локализацию мРНК. РНК в гибридизация (ISH) РНК позволяет детектировать и визуализацию конкретных последовательностей РНК в клетках и тканях. Тем не менее, оригинальные анализы РНК ISH были пригодны только для идентификации весьма обильными РНК 25, который редко относится к axonally локализованных мРНК. За последние десятилетия все более активные усилия были введены в развивающихся новых технологий, которые позволяют обнаруживать мРНК при уровне одиночных молекул <suр> 25,26. Например, певица и ее коллеги разработали ISH зондов для обнаружения мРНК в одиночных камерах, состоящий в 5 неперекрывающихся флуоресцентно меченных 50-меров (подробнее см до 27). Основное различие между указанными выше методами и одного описанного здесь является то, что позже использует 20 двойной Z-структуру (не линейная) зонды, которые обычно воздействуют ~ 1 кб область РНК процентной обеспечивающей специфичности и низким уровнем фона. Затем зонды гибридизуют с предусилителем и усилителем последовательностей, которые, наконец, флуоресцентно меченых или сопряженных с ферментами, которые позволяют хромогенных реакций. Эти шаги усиления улучшить отношение сигнал-шум по сравнению с другими технологиями ISH 28. Здесь мы опишем два протокола, используя RNAscope сочетании либо с флуоресцентной иммуноцитохимии или гистологических красителей, позволяющих аксонов counterstaining. Оба протокола предназначены для визуализации аксонов локализации мРНК в Atf4 взрослых месиспользовать и мозги человека.
В этом докладе мы описываем использование технологии ISH высоким разрешением в обнаружении axonally локализованной Atf4 мРНК. Эти и предыдущие опубликованные исследования показывают, что эта технология совместима с на основе антител обнаружения белка в тканях или даже целые эмбрионов <…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Alzheimer’s Association (NIRG-10-171721; to U.H.), National Institute of Mental Health (MH096702; to U.H.), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS081333; to C.M.T.), and pilot study awards from the National Institute on Aging-funded Alzheimer’s Disease Research Center at Columbia University (AG008702; to J.B. and Y.Y.J.) that also supports the New York Brain Bank. We thank members of the Hengst laboratory for comments and discussions
custom probe targeting residues 20-1381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716) | Advanced Cell Diagnostics | – | probe |
custom probe targeting residues 15-1256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2) | Advanced Cell Diagnostics | – | probe |
negative control probe-DapB | Advanced Cell Diagnostics | 310043 | probe |
positive control probe-mouse Polr2A (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 312471 | probe |
positive control probe-human PPIB (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 313901 | probe |
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection) | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | In situ hybridization kit |
RNAscope 2.0 HD Reagent Kit – BROWN (for chromogenic detection) | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | In situ hybridization kit |
Goat polyclonal anti-ChAT antibody | Millipore | AB144P | |
Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit | American MasterTech | KTLFB | |
Clearify clearing agent (xylene substitute) | American MasterTech | CACLEGAL | |
ProLong Gold mounting medium with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
DPX mounting medium | Sigma | 6522 |