RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.
mRNA sono spesso localizzate a assoni vertebrati ed è richiesta la loro traduzione locale per assone pathfinding o ramificazione durante lo sviluppo e per la manutenzione, la riparazione o la neurodegenerazione in periodi postdevelopmental. Analisi High Throughput hanno recentemente rivelato che gli assoni hanno un trascrittoma più dinamico e complesso di quanto previsto in precedenza. Queste analisi, tuttavia sono stati per lo più fatto in neuroni in coltura dove gli assoni possono essere isolate dai compartimenti somato-dendritiche. E 'praticamente impossibile raggiungere tale isolamento nei tessuti interi in vivo. Pertanto, al fine di verificare l'assunzione di mRNA e la loro rilevanza funzionale in un animale intero, analisi trascrittoma dovrebbero idealmente essere combinati con tecniche che permettono la visualizzazione di mRNA in situ. Recentemente, sono state sviluppate tecnologie ISH nuove che rilevano RNAs a livello di singola molecola. Ciò è particolarmente importante quando si analizza la localizzazione subcellulare di mRNA, RNA poiché localizzati trovano tipicamente a livelli bassi. Qui si descrive due protocolli per la rilevazione di mRNA assoni-localizzate utilizzando una nuova tecnologia ultrasensibile RNA ISH. Abbiamo unito RNAscope ISH con assonale di contrasto utilizzando la fluorescenza immunoistochimica o coloranti istologici per verificare l'assunzione di ATF4 mRNA di assoni in vivo nel topo matura e cervello umano.
Assonale reclutamento mRNA e traduzione locali consentono assoni di rispondere agli stimoli extracellulari in maniera temporalmente e spazialmente acuta 1. Intra-assonale sintesi proteica si comprende meglio nel contesto del neurosviluppo in cui svolge un ruolo cruciale nella crescita comportamento cono 2-8, assone Pathfinding 9-11 e retrogrado segnalazione 12,13. Ma molto meno si sa circa il significato funzionale di assonale sintesi proteica nei neuroni post-sviluppo quando i livelli di mRNA e ribosomi assonale sono notevolmente ridotte 14,15. Assoni vertebrati maturi sono stati a lungo pensato di essere traslazione attivo 16. Tuttavia, studi recenti indicano che la traduzione locale viene riattivato negli assoni maturi in condizioni patologiche. Per esempio, un sottoinsieme di mRNA viene reclutato per assoni rigeneranti seguente è richiesta lesioni nervose e intra-assonale sintesi proteica per la corretta rigenerazione di questi assoni 17. Inoltre, il nostro gruppo has dimostrato che specifici mRNA sono reclutati per assoni dopo l'esposizione locale per la malattia di Alzheimer peptide Ap 1-42, e la traduzione locale del fattore di trascrizione ATF4 è necessaria per propagare gli effetti neurodegenerativi di Ap 1-42 da assoni al soma neuronale 18. Infine, le analisi di throughput elevato hanno rivelato che gli assoni maturi hanno un trascrittoma più complesso e dinamico di quanto previsto 18-21, soprattutto in condizioni patologiche. Alla luce di questi studi, un metodo altamente sensibile e specifico per rilevare è necessario mRNA assoni localizzati nel sistema nervoso adulto.
Gran parte del lavoro sul reclutamento mRNA e traduzione locali negli assoni maturi è stata eseguita su neuroni in coltura. Ciò è particolarmente vero per le analisi del trascrittoma in quanto esistono metodi di coltura specializzate che permettono l'isolamento degli assoni dalla somato-dendritica vano 18-20. Anche se questi studi hanno dato ins preziosiight nel ruolo della traduzione locale di assoni maturi, la questione se i neuroni in coltura rappresentano fedelmente la situazione in vivo o se mRNA reclutamento è una risposta di adattamento degli assoni a condizioni di coltura è ancora aperta. Pochi studi hanno fornito prove di mRNA assunzioni a maturare assoni in vivo. Ad esempio, la trascrizione che codifica per la proteina marcatore olfattivo è stato rilevato in assoni nei neuroni sensoriali adulti 22. Un transgene contenente la 3 'UTR di β-actina mRNA viene trasportato assoni nei neuroni del sistema nervoso centrale e periferico in topi e si traduce localmente dopo periodi di sviluppo 23. Lamin b2 mRNA è localizzato a assoni retinici in Xenopues laevis girini e il suo esaurimento colpisce assone manutenzione dopo lo sviluppo assonale 21. Interferenza con il trasporto assonale della codifica mRNA per citocromo C ossidasi IV altera il comportamento del mouse 24. Infine, ATF4 mRNA si trova in adultiXON di topi e cervelli umani nel contesto di Ap 1-42 indotta neurodegenerazione 18.
Alta velocità effettiva analisi del trascrittoma hanno dimostrato di essere utile per identificare i profili di mRNA in assoni isolati in vitro, ma hanno limitazioni per studi in vivo in quanto nei tessuti interi assoni non si trovano mai isolatamente, ma mescolati con i corpi cellulari neuronali, cellule gliali e altri tipi di cellule. Pertanto, tali analisi devono essere combinati con tecniche di imaging che confermano la localizzazione subcellulare di mRNA. RNA ibridazione in situ (ISH RNA) permette la rilevazione e visualizzazione di specifiche sequenze di RNA in cellule e tessuti. Tuttavia, i saggi originali RNA ISH erano adatte solo per l'identificazione di RNA altamente abbondanti 25, che è raramente il caso di mRNA assoni localizzate. Negli ultimi decenni ci si è messi in via di sviluppo nuove tecnologie che permettono la rilevazione di mRNA a livello di singola molecola <sup> 25,26. Ad esempio, Singer e colleghi hanno sviluppato le sonde ISH per rilevare mRNA in singole cellule, che consiste in 5 non sovrapposti fluorescente 50-mers (per i dettagli si riferiscono al 27). La differenza principale tra le tecniche sopra menzionate e quella qui descritta è che la successiva utilizza 20 doppia Z-struttura (non lineare) sonde che tipicamente colpiscono ~ 1 kb regione del RNA di interesse garantire specificità e bassi livelli di fondo. Le sonde sono poi ibridati con preamplificatore e amplificatore sequenze che vengono finalmente fluorescente o coniugati con enzimi che consentono reazioni cromogeni. Questi passaggi di amplificazione migliorare il rapporto segnale-rumore, rispetto ad altre tecnologie ISH 28. Qui si descrive due protocolli che utilizzano RNAscope combinato sia con fluorescenza immunocitochimica o con coloranti istologici che permettono di contrasto assonale. Entrambi i protocolli sono adatti per visualizzare la localizzazione assonale di ATF4 mRNA in mo adultiutilizzare e cervelli umani.
In questo rapporto si descrive l'uso di una tecnologia ISH ad alta risoluzione per il rilevamento di assoni localizzato ATF4 mRNA. Questi ed precedenti studi pubblicati dimostrano che questa tecnologia è compatibile con la rilevazione di proteine a base di anticorpi in tessuti o addirittura embrioni interi 33. Importante, è stato recentemente utilizzato per il rilevamento di Arc mRNA all'interno dendriti dei neuroni ippocampali 34. Può anche essere combinato con c…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Alzheimer’s Association (NIRG-10-171721; to U.H.), National Institute of Mental Health (MH096702; to U.H.), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS081333; to C.M.T.), and pilot study awards from the National Institute on Aging-funded Alzheimer’s Disease Research Center at Columbia University (AG008702; to J.B. and Y.Y.J.) that also supports the New York Brain Bank. We thank members of the Hengst laboratory for comments and discussions
custom probe targeting residues 20-1381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716) | Advanced Cell Diagnostics | – | probe |
custom probe targeting residues 15-1256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2) | Advanced Cell Diagnostics | – | probe |
negative control probe-DapB | Advanced Cell Diagnostics | 310043 | probe |
positive control probe-mouse Polr2A (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 312471 | probe |
positive control probe-human PPIB (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 313901 | probe |
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection) | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | In situ hybridization kit |
RNAscope 2.0 HD Reagent Kit – BROWN (for chromogenic detection) | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | In situ hybridization kit |
Goat polyclonal anti-ChAT antibody | Millipore | AB144P | |
Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit | American MasterTech | KTLFB | |
Clearify clearing agent (xylene substitute) | American MasterTech | CACLEGAL | |
ProLong Gold mounting medium with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
DPX mounting medium | Sigma | 6522 |