La detección de ARNm axón localizado en las secciones cerebrales Uso de alta resolución<em> In Situ</em> La hibridación
Summary
RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.
Abstract
ARNm se localizan con frecuencia a los axones de vertebrados y de su traducción locales se requiere para pathfinding axón o ramificación durante el desarrollo y para el mantenimiento, la reparación o la neurodegeneración en períodos postdevelopmental. Análisis de alto rendimiento han revelado recientemente que los axones tienen un transcriptoma más dinámico y complejo de lo esperado. Estos análisis, sin embargo se han realizado principalmente en neuronas cultivadas, donde los axones pueden ser aislados de los compartimentos somato-dendrítica. Es prácticamente imposible de conseguir tal aislamiento en tejidos enteros en vivo. Por lo tanto, con el fin de verificar el reclutamiento de mRNAs y su relevancia funcional en un animal entero, los análisis del transcriptoma idealmente deben ser combinados con técnicas que permiten la visualización de mRNAs in situ. Recientemente, las tecnologías ISH novedosos que detectan ARN a nivel de una sola molécula se han desarrollado. Esto es especialmente importante cuando se analiza la localización subcelular de mRNA, ARN ya localizados se encuentran típicamente en niveles bajos. Aquí se describen dos protocolos para la detección de mRNAs axón localizadas utilizando un nuevo ultrasensible tecnología de ARN ISH. Hemos combinado RNAscope ISH con contratinción axonal mediante inmunohistoquímica de fluorescencia o colorantes histológicos para verificar el reclutamiento de ATF4 mRNA a los axones in vivo en el ratón madura y los cerebros humanos.
Introduction
Contratación ARNm axonal y la traducción local de los axones permiten responder a estímulos extracelulares de manera temporal y espacialmente aguda 1. La síntesis de proteínas intra-axonal se entiende mejor en el contexto del desarrollo neurológico en el que desempeña un papel crucial en el crecimiento de la conducta cono 2-8, axón pathfinding 9-11 y señalización retrógrada 12,13. Pero mucho menos se sabe acerca de la importancia funcional de la síntesis de proteínas axonal en las neuronas post-desarrollo cuando los niveles de ARNm y ribosomas axonal se reducen considerablemente 14,15. Axones vertebrados maduros durante mucho tiempo han sido considerados como translationally inactivos 16. Sin embargo, estudios recientes indican que la traducción locales se reactiva en los axones maduros en condiciones patológicas. Por ejemplo, un subconjunto de mRNAs es reclutado para regeneración de los axones se requiere lesión del nervio y la síntesis de proteínas intra-axonal para la regeneración correcta de estos axones 17 siguiente. Además, nuestro grupo has demostró que mRNAs específicos son reclutados a los axones después de que se requiere la exposición local a peptídico de la enfermedad de Alzheimer 1-42, y la traducción local de la ATF4 factor de transcripción para propagar los efectos neurodegenerativos de Aß 1-42 de axones a la soma neuronal 18. Finalmente, los análisis de alto rendimiento han revelado que los axones maduros tienen un transcriptoma más complejo y dinámico de lo esperado 18-21, especialmente bajo condiciones patológicas. A la luz de estos estudios, un método altamente sensible y específica para detectar que se necesita ARNm axón localizados en el sistema nervioso adulto.
Gran parte del trabajo en el reclutamiento de ARNm y la traducción local en axones maduros se ha realizado en las neuronas cultivadas. Esto es especialmente cierto para los análisis de transcriptoma ya que existen métodos de cultivo especializados que permiten el aislamiento de los axones de el compartimiento somato-dendrítica 18-20. Aunque estos estudios han dado valiosos complementosvuelo en el papel de la traducción local en axones maduros, la cuestión de si las neuronas cultivadas representan fielmente la situación in vivo o si ARNm reclutamiento es una respuesta adaptativa de los axones a condiciones de cultivo sigue abierta. Pocos estudios han proporcionado pruebas de la contratación ARNm para madurar axones in vivo. Por ejemplo, la que codifica para la proteína marcadora olfativo transcripción se ha detectado en los axones en las neuronas sensoriales adultas 22. Un transgén que contiene el 3 'UTR del mRNA β-actina se transporta a los axones en las neuronas del sistema nervioso periférico y central en los ratones y se traduce localmente después de períodos de desarrollo 23. ARNm Lamin b2 se localiza en los axones de la retina en Xenopues laevis renacuajos y su agotamiento afecta mantenimiento axón después del desarrollo axonal 21. Interferencia con el transporte axonal de la codificación de ARNm para citocromo C oxidasa IV altera el comportamiento del ratón 24. Por último, ATF4 ARNm se encuentra en un adultoXON de ratones y cerebros humanos en el contexto de Aß 1-42 inducida por la neurodegeneración 18.
Análisis del transcriptoma alto rendimiento han demostrado ser útiles para identificar perfiles de mRNA en los axones aislados in vitro, pero tienen limitaciones para los estudios in vivo, ya que en los tejidos enteros axones no se encuentran en forma aislada, sino entremezclados con cuerpos celulares neuronales, células gliales y otros tipos de células. Por lo tanto, este tipo de análisis tienen que ser combinado con técnicas de imagen que confirman la localización subcelular de mRNAs. ARN hibridación in situ (ISH ARN) permite la detección y visualización de las secuencias de ARN específicos en células y tejidos. Sin embargo, los ensayos originales ARN ISH eran adecuadas sólo para la identificación de los muy abundantes ARN 25, que rara vez es el caso de los ARNm axón localizadas. Desde hace décadas el aumento de los esfuerzos se han puesto en el desarrollo de nuevas tecnologías que permitan la detección de ARNm en el nivel de una sola molécula <sup> 25,26. Por ejemplo, Singer y sus colegas han desarrollado sondas ISH para detectar ARNm en las células individuales, que consiste en 5 no se solapan etiqueta fluorescente 50-meros (para más detalles, consulte 27). La principal diferencia entre las técnicas antes mencionadas y el que aquí se describe es que el más tarde utiliza 20-Z estructura doble (no lineal) sondas que normalmente se dirigen a ~ 1 kb de la región de ARN de interés asegurar la especificidad y bajos niveles de fondo. Las sondas se hibridan con secuencias de preamplificador y amplificador que finalmente están marcados con fluorescencia o conjugarse con las enzimas que permiten reacciones cromogénicos. Estos pasos de amplificación mejorar la relación señal-ruido en comparación con otras tecnologías de ISH 28. Aquí se describen dos protocolos que utilizan RNAscope combinado ya sea con inmunocitoquímica fluorescencia o con colorantes histológicos que permiten counterstaining axonal. Ambos protocolos son apropiados para visualizar la localización axonal de ATF4 mRNA en mo adultosusar y cerebros humanos.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este informe se describe el uso de una tecnología de ISH de alta resolución en la detección de mRNA ATF4 axón localizada. Estos y los anteriores estudios publicados muestran que esta tecnología es compatible con base de anticuerpos de detección de proteínas en los tejidos o incluso embriones enteros 33. Es importante destacar que se ha utilizado recientemente para la detección de Arco mRNA dentro de las dendritas de las neuronas del hipocampo 34. También se puede combi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Alzheimer’s Association (NIRG-10-171721; to U.H.), National Institute of Mental Health (MH096702; to U.H.), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS081333; to C.M.T.), and pilot study awards from the National Institute on Aging-funded Alzheimer’s Disease Research Center at Columbia University (AG008702; to J.B. and Y.Y.J.) that also supports the New York Brain Bank. We thank members of the Hengst laboratory for comments and discussions
Materials
| custom probe targeting residues 20-1381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716) | Advanced Cell Diagnostics | – | probe |
| custom probe targeting residues 15-1256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2) | Advanced Cell Diagnostics | – | probe |
| negative control probe-DapB | Advanced Cell Diagnostics | 310043 | probe |
| positive control probe-mouse Polr2A (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 312471 | probe |
| positive control probe-human PPIB (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 313901 | probe |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection) | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | In situ hybridization kit |
| RNAscope 2.0 HD Reagent Kit – BROWN (for chromogenic detection) | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | In situ hybridization kit |
| Goat polyclonal anti-ChAT antibody | Millipore | AB144P | |
| Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit | American MasterTech | KTLFB | |
| Clearify clearing agent (xylene substitute) | American MasterTech | CACLEGAL | |
| ProLong Gold mounting medium with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| DPX mounting medium | Sigma | 6522 |
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