Påvisning av Axonally Lokalisert mRNAs i hjernedelene med høy oppløsning<em> In Situ</em> Hybridisering
Summary
RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.
Abstract
mRNA er ofte lokalisert til virveldyr axoner og deres lokale oversettelse er nødvendig for axon pathfinding eller forgrening under utvikling og for vedlikehold, reparasjon eller neurodegenerering i postdevelopmental perioder. Høye throughput analyser har nylig avdekket at axons har en mer dynamisk og kompleks transkriptom enn tidligere antatt. Disse analyse, men har stort sett gjort i dyrkede nerveceller der axoner kan isoleres fra somato-dendrittiske avdelinger. Det er praktisk talt umulig å oppnå en slik isolasjon i hele vev in vivo. Således, for å verifisere at rekruttering av mRNA og deres funksjonelle relevans i et helt dyr, transkriptom analyser bør ideelt sett være kombinert med teknikker som tillater visualisering av mRNA in situ. Nylig har nye ISH teknologi som gjenkjenner RNA på en enkelt-molekyl nivå blitt utviklet. Dette er spesielt viktig når analysere den subcellulære lokalisering av mRNASiden lokaliserte RNA finnes vanligvis på lave nivåer. Her beskriver vi to protokoller for påvisning av axonally-lokaliserte mRNA ved hjelp av en ny ultra RNA ISH teknologi. Vi har kombinert RNAscope ISH med axonal counterstain med fluoresens immunhistokjemi eller histologiske fargestoffer for å verifisere rekruttering av Atf4 mRNA til axoner in vivo i moden mus og menneskehjerner.
Introduction
Axonal mRNA rekruttering og lokal oversettelse aktivere axoner å svare på ekstracellulære stimuli i en tid og rom akutt måte en. Intra-axonal proteinsyntesen er best forstås i sammenheng med neurodevelopment der den spiller avgjørende roller i vekst kjegle oppførsel 2-8, axon pathfinding 9-11 og retrograd signale 12,13. Men langt mindre er kjent om den funksjonelle betydningen av aksonal proteinsyntese i post-utviklings nevroner når aksonale mRNA og ribosom nivåer er sterkt redusert 14,15. Modne virveldyr aksoner har lenge vært antatt å være translasjonelt inaktiv 16. Men nyere studier tyder på at lokale oversettelses reaktiveres i modne aksoner etter patologiske tilstander. For eksempel, er en undergruppe av mRNA rekruttert til regenererende axoner etter nerveskade og intra-aksonal proteinsyntese er nødvendig for riktig regenerering av disse 17 aksoner. I tillegg vår gruppe has demonstrert at spesifikke mRNA blir rekruttert til axoner etter lokal eksponering for Alzheimers sykdom peptid Ap 1-42, og lokale oversettelse av transkripsjonsfaktoren ATF4 er nødvendig for å forplante nevrodegenerative effekter av Ap 1-42 fra axoner til nevronale soma 18. Endelig har høy gjennomstrømning analyser viste at modne aksoner har en mer kompleks og dynamisk transcriptome enn forventet 18-21, spesielt under patologiske tilstander. I lys av disse studiene, for en meget følsom og spesifikk metode detektere axonally lokaliserte mRNA i voksent nervesystemet er nødvendig.
Mye av arbeidet på mRNA rekruttering og lokal oversettelse i modne aksoner har blitt utført på dyrkede nerveceller. Dette gjelder særlig for transcriptome analyser siden spesialiserte dyrkningsmetoder finnes som tillater isolering av axoner fra somato-dendrittiske rommet 18-20. Selv om slike studier har gitt verdifulle insight inn i rollen som lokal oversettelse i modne aksoner, spørsmålet om dyrkede nerveceller representerer trofast situasjonen in vivo eller hvis mRNA rekruttering er en adaptiv respons av aksoner til dyrking forholdene er fortsatt åpen. Få studier har gitt holdepunkter for mRNA rekruttering til modne axoner in vivo. For eksempel har den transkripsjon koding for lukte markør protein er påvist i axoner i voksen sensoriske nevroner 22. En transgen inneholder 3 'UTR av β-aktin mRNA transporteres til axoner i perifere og sentrale nervesystemet nerveceller i mus og er lokalt oversatt etter utviklings perioder 23. Lamin b2 mRNA er lokalisert til retinal axoner i Xenopues laevis rumpetroll og dens uttømming påvirker axon vedlikehold etter aksonal utvikling 21. Interferens med aksonal transport av mRNA som koder for cytokrom C oksidase IV endrer muse atferd 24. Til slutt blir Atf4 mRNA finnes i en voksenXON av mus og menneskehjerner i sammenheng med Ap 1-42 -indusert neurodegenerering 18.
Høy gjennomstrømning transkriptom analyser har vist seg å være nyttig for å identifisere mRNA profiler i isolerte aksoner in vitro, men har begrensninger for in vivo-studier siden i hele vev aksoner finnes aldri i isolasjon, men blandet med neuronal cellelegemer, gliale celler og andre celletyper. Således kan slike analyser har til å bli kombinert med bildeteknikker som bekrefter den subcellulære lokalisering av mRNA. RNA in situ hybridisering (RNA ISH) tillater påvisning og visualisering av spesifikke RNA-sekvenser i celler og vev. Men opprinnelige RNA ISH analyser var kun egnet for identifisering av svært rike RNA 25, noe som er sjelden tilfelle for axonally lokaliserte mRNA. For de siste tiårene økende innsats har blitt satt i å utvikle nye teknologier som tillater påvisning av mRNA på enkelt-molekyl nivå <sup> 25,26. For eksempel, Singer og kolleger har utviklet ISH sonder for å oppdage mRNAs i enkeltceller, som består i fem ikke-overlapp fluoresceinmerket 50-merer (for detaljer, se 27). Den største forskjellen mellom de ovennevnte teknikker og den ene her er beskrevet, er at den senere bruker 20 double Z-struktur (ikke lineær) sonder som vanligvis er rettet mot ~ 1 kb region av RNA av interesse å sikre spesifisitet og lav bakgrunnsnivåer. Prober blir deretter hybridisert med forforsterker og forsterkersekvenser som er endelig fluorescensmerkede eller konjugert med enzymer som gjør kromogene reaksjoner. Disse forsterkertrinn forbedre signal-til-støy-forhold i forhold til andre teknologier 28 ISH. Her beskriver vi to protokoller som bruker RNAscope kombineres enten med fluorescens immunocytochemistry eller med histologiske fargestoffer slik aksonal kontra. Begge protokollene er egnet til å visualisere aksonal lokalisering av Atf4 mRNA i voksen mobruke og menneskehjerner.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne rapporten beskriver vi bruk av en høy oppløsning ISH teknologi i deteksjon av axonally lokalisert Atf4 mRNA. Disse og tidligere publiserte studier viser at denne teknologien er kompatibel med antistoff-baserte protein påvisning i vev eller hele embryoer 33. Viktigere, har det nylig blitt brukt for påvisning av Arc mRNA innen dendritter av hippocampus nevroner 34. Den kan også kombineres med histologiske fargestoffer for vev-farging. Til slutt, er det egnet for samtidi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Alzheimer’s Association (NIRG-10-171721; to U.H.), National Institute of Mental Health (MH096702; to U.H.), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS081333; to C.M.T.), and pilot study awards from the National Institute on Aging-funded Alzheimer’s Disease Research Center at Columbia University (AG008702; to J.B. and Y.Y.J.) that also supports the New York Brain Bank. We thank members of the Hengst laboratory for comments and discussions
Materials
| custom probe targeting residues 20-1381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716) | Advanced Cell Diagnostics | – | probe |
| custom probe targeting residues 15-1256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2) | Advanced Cell Diagnostics | – | probe |
| negative control probe-DapB | Advanced Cell Diagnostics | 310043 | probe |
| positive control probe-mouse Polr2A (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 312471 | probe |
| positive control probe-human PPIB (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 313901 | probe |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection) | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | In situ hybridization kit |
| RNAscope 2.0 HD Reagent Kit – BROWN (for chromogenic detection) | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | In situ hybridization kit |
| Goat polyclonal anti-ChAT antibody | Millipore | AB144P | |
| Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit | American MasterTech | KTLFB | |
| Clearify clearing agent (xylene substitute) | American MasterTech | CACLEGAL | |
| ProLong Gold mounting medium with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| DPX mounting medium | Sigma | 6522 |
References
- Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair. Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).
- Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32, 1013-1026 (2001).
- Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436, 1020-1024 (2005).
- Piper, M., et al. Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones. Neuron. 49, 215-228 (2006).
- Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. An essential role for β-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance. Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).
- Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).
- Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth. Nat. Commun. 5, 3506 (2014).
- Preitner, N., et al. APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly. Cell. 158, 368-382 (2014).
- Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target. Cell. 110, 223-235 (2002).
- Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation. Cell. 141, 632-644 (2010).
- Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay. Cell. 153, 1252-1265 (2013).
- Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).
- Ji, S. J., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification. Neuron. 74, 95-107 (2012).
- Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons. Neuron. 12, 571-582 (1994).
- Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).
- Hengst, U., Jaffrey, S. R. Function and translational regulation of mRNA in developing axons. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).
- Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome. Open Biology. 2, 120079 (2012).
- Baleriola, J., et al. Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions. Cell. 158, 1159-1172 (2014).
- Gumy, L. F., et al. Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization. RNA. 17, 85-98 (2011).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
- Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
- Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons. J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).
- Willis, D. E., et al. Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons. J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).
- Kar, A. N., et al. Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse. Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).
- Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).
- Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique. J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).
- Wang, H., et al. Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope. Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. . Theory and Practice of Histotechnology. , (1987).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biol. 12, 55 (2014).
- Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. . Theory and practice of histotechnology. , (1980).
