Stereotaxische Infusion van Oligomere amyloid-beta in de Mouse Hippocampus
Summary
Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.
Abstract
Ziekte van Alzheimer is een neurodegeneratieve ziekte die vergrijzing. Een belangrijk neuropathologische kenmerken van de ziekte is de overproductie van amyloïd-beta en de afzetting van amyloid-beta plaques in de hersenen van getroffen individuen. Door de jaren heen hebben wetenschappers gegenereerd talrijke ziekte van Alzheimer muismodellen die proberen om de amyloid-beta pathologie repliceren. Helaas, de muismodellen slechts selectief de ziekte kenmerken na te bootsen. Neuronale dood, een prominent effect in de hersenen van patiënten met de ziekte van Alzheimer, merkbaar ontbreekt in deze muizen. Vormen van amyloïd-bèta die bewezen zeer toxisch voor neuronen zijn – – Daarom hebben wij en anderen een werkwijze voor infusie direct oplosbare oligomere species van amyloïd-beta toegepast stereotaxically in de hersenen. In dit rapport gebruiken we mannelijke C57BL / 6J muizen om deze chirurgische techniek van het verhogen van amyloid-beta niveaus in een select regio hersenen documenteren. Deinfusie doel de dentate gyrus van de hippocampus omdat hersenenstructuur, samen met de basale voorhersenen dat via het cholinerge circuit, is een van de gebieden van degeneratie bij de ziekte. De resultaten verheffen amyloïd-beta in de dentate gyrus via stereotactische infusie openbaren toename neuron verlies in de dentate gyrus binnen 1 week, terwijl er een bijkomende toename in celdood en cholinerg neuron verlies in het verticale been van de diagonale band van Broca van de basale voorhersenen. Deze effecten zijn waargenomen tot 2 weken. Onze gegevens suggereren dat de huidige amyloid-beta infusie model een alternatief muizenmodel voor regiospecifieke neuron death op korte termijn te pakken. Het voordeel van dit model is dat amyloid-beta kan worden verhoogd in een ruimtelijke en temporale manier.
Introduction
Amyloid plaque afzettingen, die bestaan uit amyloid-beta (Aß 1-42), is een belangrijk kenmerk van de pathologie van de ziekte van Alzheimer (AD). Talrijke studies hebben aangetoond dat hoge giftigheidsniveaus van recombinant oligomeer Aß 1-42 opwekken neuronale dood, synaptische dystrofie, verlies en disfunctie; evenals leren en geheugen tekorten 1-4. Brain getroffen regio's zijn de hippocampus, de cortex en subcorticale structuren zoals de basale voorhersenen en de amygdala 5,6. Tot op heden zijn er meerdere transgene muismodellen die proberen te simuleren de Aß 1-42 pathologie van AD. Afhankelijk van het soort dieren die nuttig blijken bij het onderzoek select pathologische kenmerken van AD zijn. Helaas, met uitzondering van 2 transgene lijnen APP23 en 5XFAD deze muizen niet volledige replicatie neuronaal verlies, een sleutelaspect van AD. Zelfs met de neuronaal verlies waargenomen in APP23 en 5XFAD, de neuronale dood opmerved was subtiele, leeftijd afhankelijk, en geïsoleerde om een paar selecte regio's 7,8.
De directe infusie van oligomere Aß 1-42 in de wild-type muizenhersenen een uitstekend in vivo model dat de neuronale dood aspect van amyloidopathy 1,9,10 repliceert. In tegenstelling tot de vaak gebruikte transgene muismodellen de oligomere Aß 1-42 infuus model is ideaal voor acuut verheffen Aß 1-42 niveaus in een ruimtelijke en temporele manier. Het voordeel van wild-type muizen van dit model ondervangt potentiaalvereffening of bijwerkingen van de mutaties geïntroduceerd in transgene muizenlijnen. Past studies hebben aangetoond dat infusie toxische niveaus van Aß 1-42 in de hippocampus lokt neuron sterfte in de nabijheid van de injectieplaats binnen 1 week 1. Bovendien, in overeenstemming met de waarneming dat Aß 1-42 toxisch is voor cholinergische neuronen van de basale voorhersenen 11cholinergisch neuron (BFCN) populatie die uitsteekt naar de hippocampus verminderd 20-50% binnen 7-14 dagen na beta-amyloïde infusie 1,10 bij muizen, effectief waardoor de onderzoeken van geïsoleerde neuronale circuits in de hersenen. Aangezien BFCN project ipsilateraal aan de dentate gyrus van de hippocampus 12, grotendeels control / medium en oligomere Aß 1-42 oplossingen geïnjecteerd worden aan weerszijden van de hersenen toelaat vergelijkingen te maken tussen de linker en rechter hemisferen 1.
In dit rapport zullen we een gedetailleerde chirurgische en injectie methodologie voor volwassen wild-type C57BL / 6J muizen bieden. Deze muizenstam is gekozen vanwege zijn brede gebruik in onderzoek. Technisch gezien kan elk hersengebied worden gericht voor infusie, maar hier zullen we de dentate gyrus van de hippocampus als de doelstelling om de techniek te illustreren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om een succesvolle Aß 1-42 injectie bereiken van de experimentator of chirurg moet: 1) Gebruik aseptische techniek; 2) juist de hersenen regio van belang met nauwkeurige coördinaten vast te stellen; 3) kunnen de muis goed vast te de stereotactische frame hersenen genivelleerd in de AP en ML as; 4) de mogelijkheid om de micromanipulator werken met precisie; 5) zorgen voor een goede post-operatieve zorg. Als deze belangrijke stappen worden gevolgd met de muis moet de operatie zonder waarneembare infectie over…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke verlenen NS081333 (tot CMT), Alzheimer's Association subsidie NIRG-10-171721 en het National Institute of Mental Health subsidie MH096702 (tot UH), en het National Institute on Aging gefinancierde Alzheimer's Disease Research Center aan de Columbia University pilot-subsidie AG008702 (naar YYJ en JB).
Materials
| Ketamine HCl (100mg/ml) | Henry Schein Medical | 1049007 | 100 mg ketamine per 1 kg animal |
| Xylazine (20mg/ml) | Henry Schein Medical | not available | 10 mg xylazine per 1 kg animal |
| Buprenex (0.3mg/ml) | Henry Schein Medical | 1217793 | 0.1 mg buprenex per 1 kg animal |
| Aβ1-42 | David Teplow/UCLA | not available | 100 μM; This amyloid was used in the paper |
| Aβ1-42 | Bachem | H-1368 | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-80B | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Scrambled Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-46B | Can be used as control peptide for comparing Aβ1-42 |
| NU4 Antibody (Oligomeric Amyloid Antibody) | Gift from William Klein/Northwestern U. | not available | 1:2000 dilution |
| Anti-Amyloid Oligomeric Antibody (Polyclonal Rabbit) | EMD Millipore | AB9234 | May be used in place of Nu4; needs to be tested by the end user |
| 6E10 Antibody (Monoclonal Mouse) (Amyloid Antibody) | Biolegend | sig-39320 | 1:1000 dilution |
| ChAT Antibody (Polyclonal Goat) | Millipore | AB144P | 1:100 dilution |
| DeadEnd Fluorometric TUNEL system | Promega | G3250 | Follow manufacturer's directions for use |
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Use when coverslipping slides |
| Fluorogold | Fluorochrome, LLC | not available | 2% solution |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | For making 70% ethanol for sanitizing and disinfecting |
| Novex 10-20% Tricine gel | Life Technologies | EC6625BOX | For separating Aβ1-42 |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Life Technologies | LC1675 | For running 10-20% Tricine gels |
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Life Technologies | LC3675 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| SuperSignal Western Blot Enhancer | Thermo Scientific | 46640 | For enhancing Aβ1-42 signal; follow manufacturer's protocol |
| Protran BA79 Nitrocellulose Blotting Membrane, 0.1 μm | GE Healthcare Life Sciences | 10402088 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | Electrophoresis aparatus for running 10-20% Tricine gels |
| GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores |
| Refresh Optive Lubricant Eye Drops | Allergan | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores; Can be used in place of GenTeal |
| Betadine | Stoelting | 50998 | For sanitizing and disinfecting |
| Round/Tapered Spatula | VWR | 82027-490 | For opening animal mouth |
| Bulldog Serrefines Clamps (Jaw Dims. 9X1.6mm; Length 28mm) | Fine Science Tools | 18050-28 | Optional; For keeping scalp skin apart during injection |
| Straight Fine Scissors (Cutting edge 25mm; Length 11.5cm) | Fine Science Tools | 14060-11 | For cutting scalp |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Surgical Blade | Fine Science Tools | 10011-00 | For making scalp incision |
| Student Standard Pattern Forcep (Tip Dims. 2.5×1.5mm; Length 11.5cm) | Fine Science Tools | 91100-12 | For holding scalp closed during suturing |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | For shaving hair |
| T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific | TP-700 | For warming animal during surgery |
| Resusable Warmining Pad (5" x 10") | Kent Scientific | TPZ-0510FEA | For attaching it to the T/Pump warm water recirculator to warm the animal during surgery |
| Cordless Micro Drill | Stoelting | 58610 | Use 0.8mm steel burrs to drill holes in the skull |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument with Mouse & Neonatal Rat Adaptor | Stoelting | 51615 | |
| Just for Mouse Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51730 | Can use this in place of Stoelting Cat. #51615 |
| Quintessential Stereotaxic Injector | Stoelting | 53311 | |
| Dry Glass Bead Sterilizer | Stoelting | 50287 | For sterilizing stainless steel instruments |
| Sterile Surgical Drape (18" x 26") | Stoelting | 50981 | |
| Hamilton Syringe 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL | Hamilton Company | 7637-01 | For brain injection; use different syringes for different solutions |
| 29 Gauge Needle, Small Hub RN NDL | Hamilton Company | 7803-06 | For attaching to the Hamilton syringe for brain injection |
| 1 ml BD Tuberculin Syringes | VWR | BD309659 | For administering anesthesia and saline |
| 30 Gauge Needle (0.5") | VWR | BD305106 | For administering anesthesia and saline |
| Portable Electronic CS Series Scale (Ohaus) | VWR | 65500-202 | For weighing animals to determine anesthesia dose |
| Hot plate (Top Plate Dims. 7.25×7.25in) | VWR | 47751-148 | For warming animals post-surgery |
| Sofsilk Silk Suture C-1 Cutting 3/8, 12 mm | Covidien | S1173 | For closing wound |
| Vetbond Tissue Adhesive (3M) | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | Optional: for aiding in wound closure; Use with suture. |
| Cotton-Tipped Wooden-Shaft Sterile Applicators | Fisher scientific | 22-029-488 | For cleaning and drying surgical wound |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For collecting brain sections |
| VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm | VWR | 48393241 | For mounting microscope slides |
| Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter 0.2 μm | Fisher Scientific | 194-2520 | For sterilizing saline solution |
| Sterile dual tip skin markers by Viscot Medical | Medline | VIS1422SRL91 | For marking coordinates on the skull |
References
- Baleriola, J., et al. Axonally Synthesized ATF4 Transmits a Neurodegenerative Signal across Brain Regions. Cell. 158 (5), 1159-1172 (2014).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer’s amyloid beta-peptide. Nature reviews. Molecular cell biology. 8 (2), 101-112 (2007).
- Knowles, J. K., et al. The p75 neurotrophin receptor promotes amyloid-beta(1-42)-induced neuritic dystrophy in vitro and in vivo. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (34), 10627-10637 (2009).
- Troy, C. M., et al. beta-Amyloid-induced neuronal apoptosis requires c-Jun N-terminal kinase activation. Journal of neurochemistry. 77 (1), 157-164 (2001).
- Crews, L., Rockenstein, E., Masliah, E. APP transgenic modeling of Alzheimer’s disease: mechanisms of neurodegeneration and aberrant neurogenesis. Brain structure & function. 214 (2-3), 111-126 (2010).
- Gotz, J., Ittner, L. M. Animal models of Alzheimer’s disease and frontotemporal dementia. Nature reviews. Neuroscience. 9 (7), 532-544 (2008).
- Calhoun, M. E., et al. Neuron loss in APP transgenic mice. Nature. 395 (6704), 755-756 (1998).
- Oakley, H., et al. Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer’s disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26 (40), 10129-10140 (2006).
- Jean, Y. Y., et al. Caspase-2 is essential for c-Jun transcriptional activation and Bim induction in neuron death. The Biochemical journal. 455 (1), 15-25 (2013).
- Sotthibundhu, A., et al. Beta-amyloid(1-42) induces neuronal death through the p75 neurotrophin receptor. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28 (15), 3941-3946 (2008).
- Kar, S., Quirion, R. Amyloid beta peptides and central cholinergic neurons: functional interrelationship and relevance to Alzheimer’s disease pathology. Progress in brain research. 145, 261-274 (2004).
- Leranth, C., Frotscher, M. Organization of the septal region in the rat brain: cholinergic-GABAergic interconnections and the termination of hippocampo-septal fibers. The Journal of comparative neurology. 289 (2), 304-314 (1989).
- Fa, M., et al. Preparation of oligomeric beta-amyloid 1-42 and induction of synaptic plasticity impairment on hippocampal slices. Journal of visualized experiments : JoVE. (41), (2010).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. (65), (2012).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of visualized experiments : JoVE. (4), (2007).
- Jin, M., et al. Soluble amyloid beta-protein dimers isolated from Alzheimer cortex directly induce Tau hyperphosphorylation and neuritic degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (14), 5819-5824 (2011).
- Lambert, M. P., et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (11), 6448-6453 (1998).
- Masters, C. L., Selkoe, D. J. Biochemistry of amyloid beta-protein and amyloid deposits in Alzheimer disease. Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 2 (6), a006262 (2012).
- Chakrabarti, M., et al. Estrogen receptor agonists for attenuation of neuroinflammation and neurodegeneration. Brain research bulletin. 109C, 22-31 (2014).
- Cirrito, J. R., et al. In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).
- Puzzo, D., et al. Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28 (53), 14537-14545 (2008).
- Puzzo, D., et al. Endogenous amyloid-beta is necessary for hippocampal synaptic plasticity and memory. Annals of. 69 (5), 819-830 (2011).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- Fulmer, C. G., et al. Astrocyte-derived BDNF supports myelin protein synthesis after cuprizone-induced demyelination. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34 (24), 8186-8196 (2014).
- Thakker-Varia, S., et al. The neuropeptide VGF is reduced in human bipolar postmortem brain and contributes to some of the behavioral and molecular effects of lithium. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (28), 9368-9380 (2010).
- Greferath, U., et al. Enlarged cholinergic forebrain neurons and improved spatial learning in p75 knockout mice. The European journal of neuroscience. 12 (3), 885-893 (2000).
- Brashear, H. R., Zaborszky, L., Heimer, L. Distribution of GABAergic and cholinergic neurons in the rat diagonal band. Neuroscience. 17 (2), 439-451 (1986).
- Clarke, D. J. Cholinergic innervation of the rat dentate gyrus: an immunocytochemical and electron microscopical study. Brain research. 360 (1-2), 349-354 (1985).
- Garcia-Osta, A., Alberini, C. M. Amyloid beta mediates memory formation. Learning & memory. 16 (4), 267-272 (2009).
