Summary

Infusión estereotáxica de Oligomeric beta-amiloide en el hipocampo del ratón

Published: June 17, 2015
doi:

Summary

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Abstract

La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa que afecta a la población que envejece. Una característica clave neuropatológico de la enfermedad es la sobre-producción de beta-amiloide y la deposición de placas de amiloide-beta en regiones del cerebro de los individuos afectados. A lo largo de los años los científicos han generado numerosos modelos de ratón de la enfermedad de Alzheimer que intentan replicar la patología amiloide-beta. Por desgracia, los modelos de ratón solamente imitan selectivamente las características de la enfermedad. La muerte neuronal, un efecto prominente en los cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer, se carece notablemente en estos ratones. Por lo tanto, nosotros y otros han empleado un método de infundir directamente especies oligoméricas solubles de beta-amiloide – formas de beta-amiloide que se han demostrado para ser más tóxico para las neuronas – estereotáxicamente en el cerebro. En este informe utilizamos machos C57BL / 6J para documentar esta técnica quirúrgica de aumento de los niveles de amiloide-beta en una región del cerebro seleccione. Losobjetivo de infusión es el giro dentado del hipocampo, porque esta estructura cerebro, junto con el cerebro anterior basal que está conectada por el circuito colinérgica, representa una de las áreas de degeneración en la enfermedad. Los resultados de la elevación de la beta-amiloide en el giro dentado mediante infusión estereotáxico revelan aumentos en la pérdida de neuronas en el giro dentado dentro de 1 semana, mientras que hay un incremento concomitante en la muerte celular y la pérdida de neuronas colinérgicas en el miembro vertical de la banda diagonal de Broca del cerebro anterior basal. Estos efectos se observan hasta 2 semanas. Nuestros datos sugieren que el actual modelo de infusión de amiloide-beta ofrece un modelo de ratón alternativa para hacer frente a la muerte de neuronas región específica en una base a corto plazo. La ventaja de este modelo es que el amiloide-beta puede ser elevado en una forma espacial y temporal.

Introduction

Depósitos de placa amiloide, que se componen de beta-amiloide (Aß 1-42), son una característica clave de la patología de la enfermedad de Alzheimer (EA). Numerosos estudios han demostrado que los niveles elevados o tóxicos de oligomérica recombinante Aß 1-42 suscitar la muerte neuronal, distrofia sináptica, la pérdida y disfunción; así como los déficit de aprendizaje y memoria 1-4. Las regiones del cerebro afectadas incluyen el hipocampo, la corteza y las estructuras subcorticales tales como el cerebro anterior basal y el 5,6 amígdala. Hasta la fecha, hay varios modelos de ratones transgénicos que intentan simular la Aß 1-42 patología de la EA. Dependiendo de la cepa estos animales demuestran ser útiles para examinar seleccione características patológicas de la AD. Desafortunadamente, con la excepción de 2 líneas transgénicas, APP23 y 5XFAD, estos ratones no replicar completamente la pérdida neuronal, un aspecto clave de la EA. Incluso con la pérdida neuronal observada en APP23 y 5XFAD, la obser muerte neuronalved era sutil, dependiente de la edad, y aislada a una pocas regiones selectas 7,8.

La infusión directa de oligómeros Aß 1-42 en el cerebro del ratón de tipo salvaje proporciona un excelente modelo in vivo que reproduce el aspecto de la muerte neuronal en amyloidopathy 1,9,10. A diferencia de los modelos de ratones transgénicos utilizados comúnmente el modelo de infusión de Aß 1-42 oligomérica es ideal para la elevación aguda Aß 1-42 niveles de una manera espacial y temporal. La ventaja de usar los ratones de tipo salvaje para este modelo evita potenciales de compensación o los efectos secundarios de las mutaciones introducidas en líneas de ratones transgénicos. Estudios anteriores han demostrado que la infusión de niveles tóxicos de 1-42 en el hipocampo provoca la muerte de neuronas en la vecindad del sitio de inyección dentro de 1 semana 1. Además, en consonancia con la observación de que Aß 1-42 es tóxico para las neuronas colinérgicas del cerebro anterior basal 11 lacolinérgicos neurona (BFCN) población que se proyecta en el hipocampo se reduce un 20-50% dentro de 7 a 14 días después de beta-amiloide infusión de 1,10 en ratones, lo que permite de manera efectiva para los exámenes de circuitos neuronales aisladas en el cerebro. Desde proyecto BFCN ipsilateralmente para el giro dentado del hipocampo 12, para el control de la parte / vehículo y oligómeros Aß 1-42 soluciones más se puede inyectar a cada lado del cerebro que permite realizar comparaciones entre los hemisferios derecho e izquierdo y 1.

En este informe vamos a ofrecer una metodología quirúrgica e inyección detallada para adultos de tipo salvaje C57BL / 6J. Esta cepa de ratón se eligió debido a su amplio uso en la investigación. Técnicamente, cualquier región del cerebro puede ser dirigido para perfusión, sin embargo aquí usaremos el giro dentado del hipocampo como el objetivo de ilustrar la técnica.

Protocol

Nota: Para todos los experimentos con animales, institucional y directrices nacionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio fueron seguidos. 1. Preparar instrumentos quirúrgicos y soluciones para la cirugía Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos de acero inoxidable. Preparar etanol al 70% por dilución de 200 a prueba de etanol absoluto con el grado molecular de agua desionizada destilada estéril. Coloque la aguja G 29 a la jeringa Hamilto…

Representative Results

El presente método de preparación humana recombinante oligomérica 1-42 produce especies oligoméricas solubles que consiste en monómeros, dímeros, trímeros, y tetrámeros (Figura 1A). Estos especies de bajo peso molecular 1-42, pero no las fibrillas y placas, se ha demostrado en numerosos entornos para ser más tóxico para las neuronas 1,4,9,17-19. Para determinar si es o no oligómeros Aß 1-42 induce la muerte de las neuronas en el cerebro del ratón …

Discussion

Para lograr un éxito Aß 1-42 inyección experimentador o cirujano debe: 1) utilizar una técnica aséptica; 2) identificar correctamente la región del cerebro de intereses con coordenadas precisas; 3) ser capaz de asegurar adecuadamente el ratón en el marco estereotáxico con el cerebro nivelado en el eje AP y ML; 4) tener la capacidad de operar el micromanipulador con precisión; 5) garantizar la atención postoperatoria adecuada. Si se siguen estos pasos clave del ratón debe sobrevivir a la cirugía si…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares conceder NS081333 (a CMT), Asociación de Alzheimer subvención NIRG-10-171721 y el Instituto Nacional de Salud Mental de subvención MH096702 (a UH), y el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento financiados Investigación de la Enfermedad de Alzheimer Centro de la Universidad de Columbia subvención piloto AG008702 (a YYJ y JB).

Materials

Ketamine HCl (100mg/ml) Henry Schein Medical 1049007 100 mg ketamine per 1 kg animal
Xylazine (20mg/ml) Henry Schein Medical not available 10 mg xylazine per 1 kg animal
Buprenex (0.3mg/ml) Henry Schein Medical 1217793 0.1 mg buprenex per 1 kg animal
1-42 David Teplow/UCLA not available 100 μM; This amyloid was used in the paper
1-42 Bachem H-1368 Can be used in place of amyloid from the Teplow lab
1-42 American Peptide 62-0-80B Can be used in place of amyloid from the Teplow lab
Scrambled Aβ1-42 American Peptide 62-0-46B Can be used as control peptide for comparing Aβ1-42
NU4 Antibody (Oligomeric Amyloid Antibody) Gift from William Klein/Northwestern U. not available 1:2000 dilution
Anti-Amyloid Oligomeric Antibody  (Polyclonal Rabbit) EMD Millipore AB9234 May be used in place of Nu4; needs to  be tested by the end user
6E10 Antibody (Monoclonal Mouse) (Amyloid Antibody) Biolegend sig-39320 1:1000 dilution
ChAT Antibody (Polyclonal Goat) Millipore AB144P 1:100 dilution
DeadEnd Fluorometric TUNEL system Promega G3250 Follow manufacturer's directions for use
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Invitrogen P36935 Use when coverslipping slides
Fluorogold Fluorochrome, LLC not available 2% solution
Absolute Ethanol (200 proof) Fisher Scientific BP2818-4 For making 70% ethanol for sanitizing and disinfecting
Novex 10-20% Tricine gel Life Technologies EC6625BOX For separating Aβ1-42
Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) Life Technologies LC1675 For running 10-20% Tricine gels
Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) Life Technologies LC3675 For transferring 10-20% Tricine gels
SuperSignal Western Blot Enhancer Thermo Scientific 46640 For enhancing Aβ1-42 signal; follow manufacturer's protocol
Protran BA79 Nitrocellulose Blotting Membrane, 0.1 μm GE Healthcare Life Sciences 10402088 For transferring 10-20% Tricine gels
Xcell SureLock Mini-Cell Life Technologies EI0001 Electrophoresis aparatus for running 10-20% Tricine gels
GenTeal Lubricant Eye Gel Novartis not available For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores
Refresh Optive Lubricant Eye Drops Allergan not available For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores; Can be used in place of GenTeal
Betadine Stoelting 50998 For sanitizing and disinfecting
Round/Tapered Spatula  VWR 82027-490 For opening animal mouth
Bulldog Serrefines Clamps (Jaw Dims. 9X1.6mm; Length 28mm) Fine Science Tools 18050-28 Optional; For keeping scalp skin apart during injection
Straight Fine Scissors (Cutting edge 25mm; Length 11.5cm) Fine Science Tools 14060-11 For cutting scalp
#3 Scalpel Handle Fine Science Tools 10003-12
#11 Surgical Blade Fine Science Tools 10011-00 For making scalp incision
Student Standard Pattern Forcep (Tip Dims. 2.5×1.5mm; Length 11.5cm) Fine Science Tools 91100-12 For holding scalp closed during suturing
Trimmer Combo Kit Kent Scientific CL9990-1201 For shaving hair
T/Pump Warm Water Recirculator  Kent Scientific  TP-700 For warming animal during surgery
Resusable Warmining Pad (5" x 10") Kent Scientific  TPZ-0510FEA For attaching it to the T/Pump warm water recirculator to warm the animal during surgery
Cordless Micro Drill Stoelting 58610 Use 0.8mm steel burrs to drill holes in the skull
Lab Standard Stereotaxic Instrument with Mouse & Neonatal Rat Adaptor Stoelting 51615
Just for Mouse Stereotaxic Instrument Stoelting 51730 Can use this in place of Stoelting Cat. #51615
Quintessential Stereotaxic Injector Stoelting 53311
Dry Glass Bead Sterilizer Stoelting 50287 For sterilizing stainless steel instruments
Sterile Surgical Drape (18" x 26") Stoelting 50981
Hamilton Syringe 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL Hamilton Company 7637-01 For brain injection; use different syringes for different solutions
29 Gauge Needle, Small Hub RN NDL Hamilton Company 7803-06 For attaching to the Hamilton syringe for brain injection
1 ml BD Tuberculin Syringes VWR BD309659 For administering anesthesia and saline
30 Gauge Needle (0.5") VWR BD305106 For administering anesthesia and saline
Portable Electronic CS Series Scale (Ohaus) VWR 65500-202 For weighing animals to determine anesthesia dose
Hot plate (Top Plate Dims. 7.25×7.25in) VWR 47751-148 For warming animals post-surgery
Sofsilk Silk Suture C-1 Cutting 3/8, 12 mm Covidien S1173 For closing wound
Vetbond Tissue Adhesive (3M) Santa Cruz Biotechnology sc-361931 Optional: for aiding in wound closure; Use with suture.
Cotton-Tipped Wooden-Shaft Sterile Applicators Fisher scientific 22-029-488 For cleaning and drying surgical wound
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific  12-550-15 For collecting brain sections
VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm VWR 48393241 For mounting microscope slides
Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter 0.2 μm Fisher Scientific 194-2520 For sterilizing saline solution
Sterile dual tip skin markers by Viscot Medical Medline VIS1422SRL91 For marking coordinates on the skull

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Jean, Y. Y., Baleriola, J., Fà, M., Hengst, U., Troy, C. M. Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus. J. Vis. Exp. (100), e52805, doi:10.3791/52805 (2015).

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