Infusion stéréotaxique des oligomères bêta-amyloïde dans les Hippocampus souris
Summary
Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.
Abstract
La maladie d'Alzheimer est une maladie neurodégénérative qui affecte le vieillissement de la population. Une caractéristique clé neuropathologiques de la maladie est la sur-production de bêta-amyloïde et le dépôt de plaques amyloïdes bêta dans les régions du cerveau des personnes souffrantes. Tout au long des années, les scientifiques ont généré de nombreux modèles de souris de la maladie d'Alzheimer qui tentent de reproduire la pathologie bêta-amyloïde. Malheureusement, les modèles de souris seulement imitent de manière sélective les caractéristiques de la maladie. La mort neuronale, un effet important dans le cerveau des patients atteints de la maladie d'Alzheimer, est visiblement défaut dans ces souris. Par conséquent, nous et d'autres avons employé une méthode d'infuser directement espèces oligomères solubles de bêta-amyloïde – formes de bêta-amyloïde qui ont été prouvés pour être plus toxique pour les neurones – stéréotaxique dans le cerveau. Dans ce rapport, nous utilisons mâles C57BL / 6J pour documenter cette technique chirurgicale de l'augmentation des niveaux bêta-amyloïde dans une région du cerveau sélectionnez. Lecible de perfusion est le gyrus denté de l'hippocampe, car cette structure du cerveau, ainsi que le cerveau antérieur basai qui est connectée par le circuit cholinergique, représente l'un des domaines de dégénérescence dans la maladie. Les résultats de l'élévation de bêta-amyloïde dans le gyrus denté par l'intermédiaire d'infusion stéréotaxique révèlent une augmentation de la perte de neurones dans le gyrus denté pendant 1 semaine, alors qu'il ya une augmentation concomitante de la mort cellulaire et cholinergique perte de neurones dans la branche verticale de la bande diagonale de Broca du cerveau antérieur basal. Ces effets sont observés jusqu'à 2 semaines. Nos données suggèrent que le modèle actuel de perfusion bêta-amyloïde fournit un modèle de souris alternative à aborder la mort des neurones spécifiques de la région en une base à court terme. L'avantage de ce modèle est que les bêta-amyloïde peut être élevé d'une manière spatiale et temporelle.
Introduction
les dépôts amyloïdes de plaques, qui sont composés de bêta-amyloïde (Aß 1-42), sont un élément clé de la pathologie de la maladie d'Alzheimer (MA). De nombreuses études ont montré que des niveaux élevés ou toxiques d'oligomères Aß recombinant 1-42 susciter la mort neuronale, la dystrophie synaptique, la perte et la dysfonction; ainsi que l'apprentissage et la mémoire déficits 1-4. Les régions du cerveau touchées comprennent l'hippocampe, le cortex et des structures sous-corticales telles que le cerveau antérieur basal et 5,6 de l'amygdale. À ce jour, il existe des modèles de souris transgéniques multiples qui tentent de simuler l'Aß 1-42 pathologie de la MA. Selon la souche de ces animaux se révéler utile pour l'examen de sélection caractéristiques pathologiques de la MA. Malheureusement, à l'exception de deux lignées transgéniques, APP23 et 5XFAD, ces souris ne répliquent intégralement la perte neuronale, un aspect clé de la MA. Même avec la perte neuronale observée dans APP23 et 5XFAD, l'obser de mort neuronalecb était subtil, dépend de l'âge, et isolée à quelques régions de sélectionner 7,8.
La perfusion directe de oligomères Aß 1-42 dans le cerveau de souris de type sauvage fournit un excellent modèle in vivo, qui reproduit l'aspect de la mort neuronale de amyloidopathy 1,9,10. Contrairement aux modèles de souris transgéniques communément utilisées, la Aß 1-42 oligomère modèle de perfusion est idéal pour l'élévation aiguë Aß 1-42 niveaux de manière spatiale et temporelle. L'avantage d'utiliser les souris de type sauvage pour ce modèle évite les effets de compensation ou secondaires potentiels des mutations introduites dans les lignées de souris transgéniques. Des études antérieures ont montré que la perfusion des niveaux toxiques de Aß 1-42 dans l'hippocampe provoque la mort des neurones au voisinage du point d'injection pendant 1 semaine 1. En outre, cohérent avec l'observation que Aß 1-42 est toxique pour les neurones cholinergiques du cerveau antérieur du 11 basaleneurone cholinergique population (BFCN) qui fait saillie à l'hippocampe est diminuée de 20 à 50% dans un délai de sept à quatorze jours suivant la bêta-amyloïde chez la souris 1,10 infusion, ce qui permet effectivement aux examens de circuit neuronal isolé dans le cerveau. Depuis projet BFCN ipsilatéralement le gyrus denté de l'hippocampe 12, pour le contrôle de la partie / véhicule et oligomères Aß 1-42 solutions les plus peut être injecté sur chaque côté du cerveau permettant d'effectuer des comparaisons entre les hémisphères droit et gauche et 1.
Dans ce rapport, nous allons fournir une méthodologie chirurgicale et l'injection détaillé pour C57BL / 6J de type sauvage adultes. Cette souche de souris est choisi en raison de sa large utilisation dans la recherche. Techniquement, une région du cerveau peut être ciblé pour perfusion, mais ici, nous allons utiliser le gyrus denté de l'hippocampe comme cible pour illustrer la technique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour parvenir à une injection Aß 1-42 succès l'expérimentateur ou le chirurgien doit: 1) utiliser une technique aseptique; 2) identifier correctement la région du cerveau d'intérêt avec des coordonnées précises; 3) être en mesure de sécuriser convenablement la souris dans le cadre stéréotaxique avec le cerveau nivelé dans l'axe AP et ML; 4) ont la capacité de faire fonctionner le micromanipulateur avec précision; 5) assurer des soins post-opératoire appropriée. Si ces étapes cl?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l'Institut national des troubles neurologiques et des maladies accorder NS081333 (à CMT), subvention Association des NIRG-10-171721 d'Alzheimer et de l'Institut national de santé mentale subvention MH096702 (UH), et l'Institut national sur le vieillissement, la recherche financée par la maladie d'Alzheimer Centre à l'Université Columbia subvention pilote AG008702 (à YYJ et JB).
Materials
| Ketamine HCl (100mg/ml) | Henry Schein Medical | 1049007 | 100 mg ketamine per 1 kg animal |
| Xylazine (20mg/ml) | Henry Schein Medical | not available | 10 mg xylazine per 1 kg animal |
| Buprenex (0.3mg/ml) | Henry Schein Medical | 1217793 | 0.1 mg buprenex per 1 kg animal |
| Aβ1-42 | David Teplow/UCLA | not available | 100 μM; This amyloid was used in the paper |
| Aβ1-42 | Bachem | H-1368 | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-80B | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Scrambled Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-46B | Can be used as control peptide for comparing Aβ1-42 |
| NU4 Antibody (Oligomeric Amyloid Antibody) | Gift from William Klein/Northwestern U. | not available | 1:2000 dilution |
| Anti-Amyloid Oligomeric Antibody (Polyclonal Rabbit) | EMD Millipore | AB9234 | May be used in place of Nu4; needs to be tested by the end user |
| 6E10 Antibody (Monoclonal Mouse) (Amyloid Antibody) | Biolegend | sig-39320 | 1:1000 dilution |
| ChAT Antibody (Polyclonal Goat) | Millipore | AB144P | 1:100 dilution |
| DeadEnd Fluorometric TUNEL system | Promega | G3250 | Follow manufacturer's directions for use |
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Use when coverslipping slides |
| Fluorogold | Fluorochrome, LLC | not available | 2% solution |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | For making 70% ethanol for sanitizing and disinfecting |
| Novex 10-20% Tricine gel | Life Technologies | EC6625BOX | For separating Aβ1-42 |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Life Technologies | LC1675 | For running 10-20% Tricine gels |
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Life Technologies | LC3675 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| SuperSignal Western Blot Enhancer | Thermo Scientific | 46640 | For enhancing Aβ1-42 signal; follow manufacturer's protocol |
| Protran BA79 Nitrocellulose Blotting Membrane, 0.1 μm | GE Healthcare Life Sciences | 10402088 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | Electrophoresis aparatus for running 10-20% Tricine gels |
| GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores |
| Refresh Optive Lubricant Eye Drops | Allergan | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores; Can be used in place of GenTeal |
| Betadine | Stoelting | 50998 | For sanitizing and disinfecting |
| Round/Tapered Spatula | VWR | 82027-490 | For opening animal mouth |
| Bulldog Serrefines Clamps (Jaw Dims. 9X1.6mm; Length 28mm) | Fine Science Tools | 18050-28 | Optional; For keeping scalp skin apart during injection |
| Straight Fine Scissors (Cutting edge 25mm; Length 11.5cm) | Fine Science Tools | 14060-11 | For cutting scalp |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Surgical Blade | Fine Science Tools | 10011-00 | For making scalp incision |
| Student Standard Pattern Forcep (Tip Dims. 2.5×1.5mm; Length 11.5cm) | Fine Science Tools | 91100-12 | For holding scalp closed during suturing |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | For shaving hair |
| T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific | TP-700 | For warming animal during surgery |
| Resusable Warmining Pad (5" x 10") | Kent Scientific | TPZ-0510FEA | For attaching it to the T/Pump warm water recirculator to warm the animal during surgery |
| Cordless Micro Drill | Stoelting | 58610 | Use 0.8mm steel burrs to drill holes in the skull |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument with Mouse & Neonatal Rat Adaptor | Stoelting | 51615 | |
| Just for Mouse Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51730 | Can use this in place of Stoelting Cat. #51615 |
| Quintessential Stereotaxic Injector | Stoelting | 53311 | |
| Dry Glass Bead Sterilizer | Stoelting | 50287 | For sterilizing stainless steel instruments |
| Sterile Surgical Drape (18" x 26") | Stoelting | 50981 | |
| Hamilton Syringe 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL | Hamilton Company | 7637-01 | For brain injection; use different syringes for different solutions |
| 29 Gauge Needle, Small Hub RN NDL | Hamilton Company | 7803-06 | For attaching to the Hamilton syringe for brain injection |
| 1 ml BD Tuberculin Syringes | VWR | BD309659 | For administering anesthesia and saline |
| 30 Gauge Needle (0.5") | VWR | BD305106 | For administering anesthesia and saline |
| Portable Electronic CS Series Scale (Ohaus) | VWR | 65500-202 | For weighing animals to determine anesthesia dose |
| Hot plate (Top Plate Dims. 7.25×7.25in) | VWR | 47751-148 | For warming animals post-surgery |
| Sofsilk Silk Suture C-1 Cutting 3/8, 12 mm | Covidien | S1173 | For closing wound |
| Vetbond Tissue Adhesive (3M) | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | Optional: for aiding in wound closure; Use with suture. |
| Cotton-Tipped Wooden-Shaft Sterile Applicators | Fisher scientific | 22-029-488 | For cleaning and drying surgical wound |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For collecting brain sections |
| VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm | VWR | 48393241 | For mounting microscope slides |
| Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter 0.2 μm | Fisher Scientific | 194-2520 | For sterilizing saline solution |
| Sterile dual tip skin markers by Viscot Medical | Medline | VIS1422SRL91 | For marking coordinates on the skull |
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