Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.
Alzheimers sykdom er en nevrodegenerativ sykdom som påvirker den aldrende befolkning. En nøkkel nevropatologiske trekk ved sykdommen er overproduksjon av amyloid-beta og avsetning av amyloid-beta plakk i hjernen regioner av de berørte individer. Gjennom årene har forskere generert mange Alzheimers sykdom musemodeller som forsøker å gjenskape amyloid-beta patologi. Dessverre, de musemodeller bare selektivt ligne sykdommen funksjoner. Neuronal død, en fremtredende effekt i hjernen til Alzheimers sykdom pasienter, er merkbart mangler i disse musene. Derfor har vi og andre ansatt en metode for direkte infusjonen løselige oligomeriske arter av amyloid-beta – former amyloid-beta som har vist seg å være mest giftig for nervecellene – stereotaksikalt inn i hjernen. I denne rapporten benytter vi mannlige C57BL / 6J mus for å dokumentere dette kirurgisk teknikk for å øke amyloid-beta nivåer i en utvalgt hjernen regionen. Deninfusjon målet er dentate gyrus av hippocampus, fordi denne hjerne struktur, sammen med den basale forhjerne som er forbundet med det kolinerge kretsen, representerer en av de områdene av degenerasjon i sykdommen. Resultatene av å heve amyloid-beta i gyrus dentatus via stereotaksisk tilførsel avsløre økning i tap av nevroner i gyrus dentatus innen en uke, mens det er en samtidig økning i celle-død og cholinergisk neuron tap i den vertikale gren av den diagonale bånd av Broca av den basale forhjerne. Disse effektene er observert opptil to uker. Våre data tyder på at dagens amyloid-beta infusjon modellen gir en alternativ musemodell for å løse region bestemt nevron død i en kortsiktig basis. Fordelen med denne metoden er at amyloid-beta kan heves i et romlig og tidsmessig måte.
Amyloid plakk innskudd, som er sammensatt av amyloid-beta (Ap 1-42), er en viktig funksjon i patologi av Alzheimers sykdom (AD). Tallrike studier har vist at høye eller giftige nivåer av rekombinant oligomert Ap 1-42 framprovosere neuronal død, synaptisk dystrofi, tap og dysfunksjon; samt lærings- og hukommelsessvikt 1-4. Hjerneområder berøres er blant annet hippocampus, cortex og subkortikale strukturer som basal forhjerne og amygdala 5,6. Til dags dato er det flere transgene musemodeller som forsøker å simulere Ap 1-42 patologi AD. Avhengig av belastningen disse dyrene vise seg å være nyttig i behandlingen enkelte patologiske trekk ved AD. Dessverre, med unntak av to transgene linjer, APP23 og 5XFAD, disse musene aldri helt replikere neuronal tap, en sentral del av AD. Selv med nevronale tap observert i APP23 og 5XFAD, den neuronal død dialektikkenVed var subtile, aldersavhengig, og isolert til noen få utvalgte regioner 7,8.
Den direkte tilførsel av oligomere Ap 1-42 inn i villtype-mus hjernen gir en utmerket in vivo-modell som replikerer neuronal død aspekt av amyloidopathy 1,9,10. I motsetning til vanlig benyttes transgene musemodeller oligomert Ap 1-42 infusjon modellen er ideell for akutt heve Ap 1-42 nivåer i en romlig og tidsmessig måte. Fordelen med å bruke villtype mus for denne modellen unngår potensielle erstatnings eller bivirkninger fra mutasjoner introdusert i transgene mus linjer. Tidligere studier har vist at infusjonen giftige nivåer av Ap 1-42 inn i hippocampus utløser neuron død i nærheten av injeksjonsstedet i løpet av en uke en. Dessuten, i overensstemmelse med den observasjon at Ap 1-42 er giftig for kolinerge neuroner 11 den basale forhjernekolinerg neuron (BFCN) populasjonen som rager til hippocampus er redusert 20-50% i løpet av 7-14 dager etter beta-amyloid infusjon 1,10 i mus, effektivt slik at for undersøkelser av isolerte neuronal kretser i hjernen. Siden BFCN prosjekt ipsilateralt til dentate gyrus av hippocampus 12, for det meste kontroll / kjøretøyet og oligomere Ap 1-42 oppløsninger kan sprøytes på hver side av hjernen slik at sammenligningene gjøres mellom venstre og høyre hjernehalvdel 1.
I denne rapporten vil vi gi en detaljert kirurgisk og injeksjon metode for voksne villtype C57BL / 6J mus. Denne musestamme er valgt på grunn av sin brede anvendelse i forskning. Teknisk sett kan en hvilken som helst hjerneregionen være målrettet for infusjon, men her vil vi bruke dentate gyrus av hippocampus som mål å illustrere teknikk.
For å oppnå en vellykket Ap 1-42 injeksjon eksperimentator eller kirurg må: 1) bruke aseptisk teknikk; 2) korrekt identifisere hjernen regionen av interesse med nøyaktige koordinater; 3) være i stand til å sikre riktig mus i stereotaxic ramme med hjernen flatet i AP og ML-aksen; 4) har evnen til å operere mikromanipluatoren med presisjon; 5) sikre riktig postoperativ omsorg. Hvis disse viktige trinnene er fulgt musen skal overleve operasjonen uten observerbar infeksjon.
I s…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Institute of nevrologiske lidelser og hjerneslag gi NS081333 (til CMT), Alzheimers Association stipend NIRG-10-171721 og National Institute of Mental Health tilskuddet MH096702 (UH) og National Institute on Aging-finansierte Alzheimers sykdom Forskning Center ved Columbia University pilot tilskuddet AG008702 (til YYJ og JB).
Ketamine HCl (100mg/ml) | Henry Schein Medical | 1049007 | 100 mg ketamine per 1 kg animal |
Xylazine (20mg/ml) | Henry Schein Medical | not available | 10 mg xylazine per 1 kg animal |
Buprenex (0.3mg/ml) | Henry Schein Medical | 1217793 | 0.1 mg buprenex per 1 kg animal |
Aβ1-42 | David Teplow/UCLA | not available | 100 μM; This amyloid was used in the paper |
Aβ1-42 | Bachem | H-1368 | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-80B | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
Scrambled Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-46B | Can be used as control peptide for comparing Aβ1-42 |
NU4 Antibody (Oligomeric Amyloid Antibody) | Gift from William Klein/Northwestern U. | not available | 1:2000 dilution |
Anti-Amyloid Oligomeric Antibody (Polyclonal Rabbit) | EMD Millipore | AB9234 | May be used in place of Nu4; needs to be tested by the end user |
6E10 Antibody (Monoclonal Mouse) (Amyloid Antibody) | Biolegend | sig-39320 | 1:1000 dilution |
ChAT Antibody (Polyclonal Goat) | Millipore | AB144P | 1:100 dilution |
DeadEnd Fluorometric TUNEL system | Promega | G3250 | Follow manufacturer's directions for use |
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Use when coverslipping slides |
Fluorogold | Fluorochrome, LLC | not available | 2% solution |
Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | For making 70% ethanol for sanitizing and disinfecting |
Novex 10-20% Tricine gel | Life Technologies | EC6625BOX | For separating Aβ1-42 |
Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Life Technologies | LC1675 | For running 10-20% Tricine gels |
Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Life Technologies | LC3675 | For transferring 10-20% Tricine gels |
SuperSignal Western Blot Enhancer | Thermo Scientific | 46640 | For enhancing Aβ1-42 signal; follow manufacturer's protocol |
Protran BA79 Nitrocellulose Blotting Membrane, 0.1 μm | GE Healthcare Life Sciences | 10402088 | For transferring 10-20% Tricine gels |
Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | Electrophoresis aparatus for running 10-20% Tricine gels |
GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores |
Refresh Optive Lubricant Eye Drops | Allergan | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores; Can be used in place of GenTeal |
Betadine | Stoelting | 50998 | For sanitizing and disinfecting |
Round/Tapered Spatula | VWR | 82027-490 | For opening animal mouth |
Bulldog Serrefines Clamps (Jaw Dims. 9X1.6mm; Length 28mm) | Fine Science Tools | 18050-28 | Optional; For keeping scalp skin apart during injection |
Straight Fine Scissors (Cutting edge 25mm; Length 11.5cm) | Fine Science Tools | 14060-11 | For cutting scalp |
#3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
#11 Surgical Blade | Fine Science Tools | 10011-00 | For making scalp incision |
Student Standard Pattern Forcep (Tip Dims. 2.5×1.5mm; Length 11.5cm) | Fine Science Tools | 91100-12 | For holding scalp closed during suturing |
Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | For shaving hair |
T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific | TP-700 | For warming animal during surgery |
Resusable Warmining Pad (5" x 10") | Kent Scientific | TPZ-0510FEA | For attaching it to the T/Pump warm water recirculator to warm the animal during surgery |
Cordless Micro Drill | Stoelting | 58610 | Use 0.8mm steel burrs to drill holes in the skull |
Lab Standard Stereotaxic Instrument with Mouse & Neonatal Rat Adaptor | Stoelting | 51615 | |
Just for Mouse Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51730 | Can use this in place of Stoelting Cat. #51615 |
Quintessential Stereotaxic Injector | Stoelting | 53311 | |
Dry Glass Bead Sterilizer | Stoelting | 50287 | For sterilizing stainless steel instruments |
Sterile Surgical Drape (18" x 26") | Stoelting | 50981 | |
Hamilton Syringe 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL | Hamilton Company | 7637-01 | For brain injection; use different syringes for different solutions |
29 Gauge Needle, Small Hub RN NDL | Hamilton Company | 7803-06 | For attaching to the Hamilton syringe for brain injection |
1 ml BD Tuberculin Syringes | VWR | BD309659 | For administering anesthesia and saline |
30 Gauge Needle (0.5") | VWR | BD305106 | For administering anesthesia and saline |
Portable Electronic CS Series Scale (Ohaus) | VWR | 65500-202 | For weighing animals to determine anesthesia dose |
Hot plate (Top Plate Dims. 7.25×7.25in) | VWR | 47751-148 | For warming animals post-surgery |
Sofsilk Silk Suture C-1 Cutting 3/8, 12 mm | Covidien | S1173 | For closing wound |
Vetbond Tissue Adhesive (3M) | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | Optional: for aiding in wound closure; Use with suture. |
Cotton-Tipped Wooden-Shaft Sterile Applicators | Fisher scientific | 22-029-488 | For cleaning and drying surgical wound |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For collecting brain sections |
VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm | VWR | 48393241 | For mounting microscope slides |
Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter 0.2 μm | Fisher Scientific | 194-2520 | For sterilizing saline solution |
Sterile dual tip skin markers by Viscot Medical | Medline | VIS1422SRL91 | For marking coordinates on the skull |