Водной Микробная Metaproteomics рабочего процесса: от клеток до триптической пептидов Подходит для тандемной масс-спектрометрии на основе анализа
Summary
This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.
Abstract
Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.
Introduction
Микроорганизмы вездесущи и играют существенную роль в биогеохимических циклах Земли 1. В настоящее время существует множество подходов молекулярной доступные для характеристики структуры микробного сообщества и функции. Наиболее распространенным является анализ гена 16S рРНК ПЦР-амплифицировали из ДНК окружающей среды 2 – 4. Недостатком анализа генов 16S рРНК, что это только предоставляет информацию о филогенетического идентичности и структуры сообществ, с мало информации о метаболической функции. В отличие от этого, подходов, таких как метагеномика, metatranscriptomics и metaproteomics предоставить информацию о структуре и метаболизме сообщества. Метагеномика, или анализ содержания генов в сборке организмов, дает информацию о структуре и функциональным возможностям сообщества 5 – 8. Несмотря на то, мощный, это функциональный потенциал может не соответствовать метаболическихДеятельность организмов. Генотип организма представлена его генов, каждый из которых может быть транскрибируется в РНК и затем переведены на белок, в результате чего фенотип. Таким образом, чтобы помочь в понимании микробной функциональной активности в среде, после геномный анализ должен быть выполнен 9. Metatranscriptomics или анализ РНК-транскриптов является полезным, поскольку он показывает, какие гены транскрибируются в любой среде. Тем не менее, уровни мРНК не всегда совпадают соответствующие их уровни белка за счет поступательного регулирования, РНК полураспада, и в том, что несколько белков копии могут быть сформированы для каждого мРНК 10.
По этим причинам metaproteomics в настоящее время признается в качестве важного инструмента для микробиологии окружающей среды. Общие metaproteomic анализирует использовать дробовик протеомный подход, при котором рядом с полным комплектом белков в комплексе образца очищают и проанализированы одновременно, как правило, через анzymatic пищеварения в пептиды и анализа на масс-спектрометре. После тандемной масс-спектрометрии (МС / МС) "пептид отпечатков пальцев" используется для определения пептидную последовательность и потенциальную белок происхождения по базе данных белков поиск (для обзора см 11). Протеомный работа долгий путь за последние 25 лет благодаря увеличению доступности данных геномной и увеличения чувствительности и точности масс-спектрометров, позволяющих идентификации белков с высокой пропускной и количественного 11,12. Так белки конечный продукт экспрессии гена, metaproteomic данные могут помочь определить, какие организмы являются активными в любой среде, и какие белки они выражают. Это выгодно, когда пытаются определить, как конкретный набор параметров окружающей среды влияет на фенотип организма или сообщества. Ранее, МС / МС на основе metaproteomic исследования в океане были использованы для выявления специфических белков в целевыхмикробные клоны, с первого исследования, посвященного света приводом протонного насоса proteorhodopsin в SAR11 морских бактерий. 13 Совсем недавно, сравнительные анализы metaproteomic выяснены дифференциальные паттерны экспрессии белка между сложными сообществами. Примеры включают в себя идентификацию временных сдвигов в обмене веществ в прибрежной Северо-Западного Атлантического океана 14 или Антарктического полуострова 5. Другие исследования описаны изменения в белковых паттернов экспрессии по пространственных масштабах, например, вдоль географического разреза от низкой питательной океана круговорота в высокопроизводительной системе прибрежного апвеллинга 15. Для дальнейших обзоров metaproteomics мы рекомендуем Шнайдер и др. (2010) 9 и Уильямс и др. (2014) 16. Целевые протеомики также использованы в последние годы для количественного экспрессии специфических метаболических путей в среде 17,18.
Therе три основные фазы в metaproteomic анализа. Первый этап подготовки образца, который включает в себя взятие проб, лизис клеток и концентрации белка. Сбор образцов в морской микробиологии часто влечет за собой фильтрацию морской воды через предварительный фильтр для удаления более крупных эукариотических клеток, частиц и частиц-ассоциированных бактерий, с последующей фильтрацией для захвата свободных живой микробных клеток, обычно с использованием картриджа 0,22 мкм Фильтрующий блок 19,20. Эти фильтры incased в пластиковом цилиндре и лизис клеток и протокол экстракции белка, который может быть выполнен в блоке фильтров будет ценным инструментом. После биомасса получена, клетки лизируют необходимо для обеспечения извлечения белка. Могут быть использованы различные способы, в том числе гуанидин-HCl лизиса 21 и натрия додецилсульфата (SDS) основе методов лизиса. Несмотря на то, моющие средства, такие как SDS являются очень эффективными на срыв мембраны и растворении многих типов белковых, КонцентрацONS цене 0,1% может помешать с выходным пищеварения белков и анализа MS 22. Серьезную озабоченность является негативное воздействие на SDS трипсина эффективности пищеварения, разрешающая способность обратной фазы жидкостной хроматографии и подавления ионов или накопления внутри источника ионов 23.
Вторая фаза фракционирования и анализ, в котором белки подвергают ферментативному расщеплению с последующим анализом ЖХ МС / МС, в результате чего AM / г структуры фрагментации, который может использоваться, чтобы установить первичный аминокислотную последовательность начальной трипсином пептида. Различные методы пищеварения могут быть выполнены в зависимости от типов используемых моющих средств, а также вниз по течению процесса массового спектрометрии. В нашем протокола, 1-D электрофореза PAGE с последующим удалением SDS из геля используется для удаления любых загрязнений моющего средства. Анализ белков, которые трудно растворить, например, мембранные белки, требует использования высокой концентратраций SDS или других моющих средств. Это приводит к проблемам совместимости с SDS-электрофореза в геле. Если цель исследования требует солюбилизации эти трудно растворить белки, система трубки-гель может быть использован 22,24. Способ трубки-гель включает белки в матрице геля без использования электрофореза. Впоследствии любые моющие средства, используемые для растворения удаляются перед переваривания белков.
Третий этап является биоинформатики анализ. На этом этапе данные пептидные MS / MS ищутся в базе данных переведенных нуклеотидных последовательностей для определения пептиды и белки присутствуют в образце. Идентификация пептидов зависит от базы данных оно искали против. Морские metaproteomic данные обычно искали с базами данных, состоящих из опорных геномов, метагеномных данных, таких как Global Ocean Sampling наборе 25, а также одноклеточные усиливается геномов из необработанной Lineages 26,27. Белки также идентификацию может быть увеличена за счет включения в метагеномных последовательностей из того же образца, как metaproteomic данные были получены 5.
Здесь мы предлагаем протокол для генерации пептидов, пригодных для МС / МС анализа на основе биомассы из микробных собирали фильтрованием и хранящихся в растворе стабилизации РНК. Протокол, описанный здесь, обеспечивает ДНК и белка, которые будут выделены из того же образца, так что все шаги, ведущей к белку и осадки ДНК идентичны. С практической точки зрения, менее фильтрации требуется, так как только один фильтр необходим для белка и экстракции ДНК. Мы также хотели бы отметить, что этот протокол был создан благодаря сочетанию, адаптации и модификации двух ранее опубликованных протоколов. Шаги лизиса клеток адаптированы из Саито и соавт. (2011) 28 и трипсина в геле переварить компонент приспособлен от ShevcheНКО и др. (2007) 29.
Protocol
Representative Results
Discussion
Образец сохранение является ключом к metaproteomic исследований и предыдущая работа показала, что раствор стабилизации РНК является полезным буфер хранения для хранения клеток до извлечения белка 28. В идеале, образцы будут сохранены на месте, чтобы свести на нет изменения в экспр?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Marcos Di Falco for his expertise and advice with the preparation of the samples for nano-LC MS/MS as well as Dr. Zoran Minic from the University of Regina for the LC MS/MS analysis. This work was supported by NSERC (DG402214-2011) and CRC (950-221184) funding. D.C. was supported by Concordia Institute for Water, Energy, and Sustainable Systems and FQRNT.
Materials
| Sterivex -GP 0.22 μm filter unit | Millipore | SVGP01050 | Sampling |
| RNAlater Stabilization Solution | Ambion | AM7021 | Sampling |
| Tris | Bio Basic | 77-86-1 or TB0196-500G | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | Protein Extraction |
| SDS | Bio Basic | 15-21-3 | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| EDTA | Bio Basic | 6381-92-6 | Protein Extraction |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Protein Extraction |
| 10K Amicon Filter | Millipore | UFC801024 | Protein Extraction |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | Protein Precipitation |
| Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | Protein Precipitation |
| MPC Protein Precipitation reagent | Epicenter | mmP03750 | DNA Precipitation |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | DNA Precipitation |
| Qubit dsDNA BR Assay kit | Life Technologies | Q32850 | DNA Quantification |
| Qubit Protein Assay kit | Life Technologies | Q33211 | Protein Quantification |
| Sucrose | Bio Basic | 57-50-1 | SDS PAGE gel |
| TEMED | Bio Rad | 161-0800 | SDS PAGE gel |
| APS | Bio Rad | 161-0700 | SDS PAGE gel |
| 30% Acrylamide | Bio Rad | 161-0158 | SDS PAGE gel |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | SDS PAGE gel |
| Glycine | Bio Rad | 161-0718 | SDS PAGE gel |
| B-mercaptoethanol | Bio Basic | 60-24-2 | SDS PAGE gel |
| Laemmli Sample Buffer | Bio Rad | 161-0737 | SDS PAGE gel |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder | Bio Rad | 161-0375EDU | SDS PAGE gel |
| Acetonitrile | VWR | CABDH6044-4 | In-gel Trypsin digest |
| NH4HCO3 | Bio Basic | 1066-33-7 | In-gel Trypsin digest |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | In-gel Trypsin digest |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500ML | In-gel Trypsin digest |
| HPLC grade H2O | Sigma-Aldrich | 270733-4L | In-gel Trypsin digest |
| Iodoacetamide | Bio Basic | 144-48-9 | In-gel Trypsin digest |
| Trypsin | Promega | V5111 | In-gel Trypsin digest |
| Protein LoBind Tube 1.5ml | Eppendorf | 22431081 | In-gel Trypsin digest |
| 2mL ROBO vial 9mm | Candian Life Science | VT009/C395SB | In-gel Trypsin digest |
| PP BM insert, No spring | Candian Life Science | 4025P-631 | In-gel Trypsin digest |
References
- Madsen, E. L. Microorganisms and their roles in fundamental biogeochemical cycles. Current opinion in biotechnology. 22 (3), 456-464 (2011).
- El-Swais, H., Dunn, K. A., Bielawski, J. P., Li, W. K. W., Walsh, D. A. Seasonal assemblages and short-lived blooms in coastal northwest Atlantic Ocean bacterioplankton. Environmental microbiology. , (2014).
- Galand, P. E., Potvin, M., Casamayor, E. O., Lovejoy, C. Hydrography shapes bacterial biogeography of the deep Arctic Ocean. The ISME journal. 4 (4), 564-576 (2010).
- Lane, D. J., Pace, B., Olsen, G. J., Stahlt, D. A., Sogint, M. L., Pace, N. R. Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4972 (1986).
- Williams, T. J., Long, E., et al. A metaproteomic assessment of winter and summer bacterioplankton from Antarctic Peninsula coastal surface waters. The ISME journal. 6 (10), (2012).
- Sheik, C. S., Jain, S., Dick, G. J. Metabolic flexibility of enigmatic SAR324 revealed through metagenomics and metatranscriptomics. Environmental microbiology. 16 (1), 304-317 (2014).
- Venter, J. C., Remington, K., et al. Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea. Science (New York, N.Y.). 304, 66-74 (2004).
- Tyson, G. W., Chapman, J., et al. Community structure and metabolism through reconstruction of microbial genomes from the environment. Nature. 428, 37-43 (2004).
- Schneider, T., Riedel, K. Environmental proteomics: analysis of structure and function of microbial communities. Proteomics. 10 (4), 785-798 (2010).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature reviews. Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
- Hettich, R. L., Pan, C., Chourey, K., Giannone, R. J. Metaproteomics: harnessing the power of high performance mass spectrometry to identify the suite of proteins that control metabolic activities in microbial communities. Analytical chemistry. 85 (9), 4203-4214 (2013).
- Von Bergen, M., Jehmlich, N., et al. Insights from quantitative metaproteomics and protein-stable isotope probing into microbial ecology. The ISME journal. 7 (10), 1877-1885 (2013).
- Giovannoni, S. J., Bibbs, L., et al. Proteorhodopsin in the ubiquitous marine bacterium SAR11. Nature. 438 (7064), 82-85 (2005).
- Georges, A. A., El-Swais, H., Craig, S. E., Li, W. K., Walsh, D. A. Metaproteomic analysis of a winter to spring succession in coastal northwest Atlantic Ocean microbial plankton. The ISME journal. , 1-13 (2014).
- Morris, R. M., Nunn, B. L., Frazar, C., Goodlett, D. R., Ting, Y. S., Rocap, G. Comparative metaproteomics reveals ocean-scale shifts in microbial nutrient utilization and energy transduction. The ISME journal. 4 (5), 673-685 (2010).
- Williams, T. J., Cavicchioli, R. Marine metaproteomics: deciphering the microbial metabolic food web. Trends in microbiology. 22 (5), 248-260 (2014).
- Saito, M. a., McIlvin, M. R., et al. Multiple nutrient stresses at intersecting Pacific Ocean biomes detected by protein biomarkers. Science. 345 (6201), 1173-1177 (2014).
- Bertrand, E., Moran, D., McIlvin, M., Hoffman, J., Allen, A., Saito, M. Methionine synthase interreplacement in diatom cultures and communities: Implications for the persistence of B12 use by eukaryotic phytoplankton. Limnology and Oceanography. 58 (4), 1431-1450 (2013).
- Hawley, A. K., Kheirandish, S., et al. Molecular tools for investigating microbial community structure and function in oxygen-deficient marine waters. Methods in enzymology. 531, 305-329 (2013).
- Da Walsh, ., Zaikova, E., Hallam, S. J. Small volume (1-3L) filtration of coastal seawater samples. Journal of visualized experiments: JoVE. (28), 1-2 (2009).
- Thompson, M., Chourey, K. Experimental approach for deep proteome measurements from small-scale microbial biomass samples. Analytical. 80 (24), 9517-9525 (2008).
- Lu, X., Digestion Zhu, H. . Tube-Gel. , 1948-1958 (2005).
- Sharma, R., Dill, B. D., Chourey, K., Shah, M., VerBerkmoes, N. C., Hettich, R. L. Coupling a detergent lysis/cleanup methodology with intact protein fractionation for enhanced proteome characterization. Journal of proteome research. 11 (12), 6008-6018 (2012).
- Santoro, A. E., Dupont, C. L., et al. Genomic and proteomic characterization of “Candidatus Nitrosopelagicus brevis”: An ammonia-oxidizing archaeon from the open ocean. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (4), 1173-1178 (2015).
- Rusch, D. B., Halpern, A. L., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling expedition: northwest Atlantic through eastern tropical Pacific. PLoS biology. 5 (3), e77 (2007).
- Swan, B. K., Martinez-Garcia, M., et al. Potential for chemolithoautotrophy among ubiquitous bacteria lineages in the dark ocean. Science (New York, N.Y.). 333 (6047), 1296-1300 (2011).
- Rinke, C., Schwientek, P., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
- Saito, M. A., Bulygin, V. V., Moran, D. M., Taylor, C., Scholin, C. Examination of microbial proteome preservation techniques applicable to autonomous environmental sample collection. Frontiers in microbiology. 2, 215 (2011).
- Shevchenko, A., Tomas, J. H., Olsen, J., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856-2860 (2007).
- Thomas, T., Gilbert, J., Meyer, F. Metagenomics – a guide from sampling to data analysis. Microbial Informatics and Experimentation. 2 (1), 3 (2012).
- Huson, D. H., Auch, A. F., Qi, J., Schuster, S. C. MEGAN analysis of metagenomic data. Genome research. 17 (3), 377-3786 (2007).
- Huson, D. H., Mitra, S., Ruscheweyh, H. -. J., Weber, N., Schuster, S. C. Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4. Genome research. 21 (9), 1552-1560 (2011).
- Ea Ottesen, ., Marin, R., et al. Metatranscriptomic analysis of autonomously collected and preserved marine bacterioplankton. The ISME journal. 5 (12), 1881-1895 (2011).
- Feike, J., Jürgens, K., Hollibaugh, J. T., Krüger, S., Jost, G., Labrenz, M. Measuring unbiased metatranscriptomics in suboxic waters of the central Baltic Sea using a new in situ fixation system. The ISME journal. 6 (2), 461-470 (2012).
