Isolering af leukocytter fra Human Maternal-føtal grænseflade

Summary

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis – the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Abstract

Graviditet er karakteriseret ved infiltrering af leukocytter i de reproduktive væv og ved maternel-føtal grænseflade (decidua basalis og decidua parietalis). Dette interface er den anatomiske kontaktstedet mellem maternal og føtale væv; derfor er det et immunologisk virkningssted under graviditet. Infiltrerende leukocytter på maternel-føtal grænseflade spiller en central rolle i implantation, graviditet vedligeholdelse, og timingen af ​​levering. Derfor vil fænotypiske og funktionelle karakterisering af disse leukocytter give indsigt i de mekanismer, der fører til graviditet lidelser. Adskillige protokoller er blevet beskrevet for at isolere infiltrerende leukocytter fra decidua basalis og decidua parietalis; Men den manglende sammenhæng i de reagenser, enzymer og tidspunkter inkubation gør det vanskeligt at sammenligne disse resultater. Beskrevet heri er en ny tilgang, der kombinerer brugen af ​​blide mekaniske og enzymatiske dissociation teknikker til at bevare levedygtigheden og integriteten af ​​ekstracellulære og intracellulære markører i leukocytter isoleret fra humane væv ved maternel-føtal interface. Bortset fra immunfænotypebestemmelse, cellekultur, og celle sortering, de fremtidige anvendelser af denne protokol er mange og varierede. Efter denne protokol, kan de isolerede leukocytter anvendes til at bestemme DNA-methylering, ekspression af målgener, in vitro leukocyt-funktionalitet (dvs. fagocytose, cytotoksicitet, T-celleproliferation, og plasticitet, etc.), og produktionen af reaktive oxygenarter ved maternel-føtal interface. Derudover anvendelse af den beskrevne protokol, har dette laboratorium kunnet beskrive nye og sjældne leukocytter ved maternel-føtal interface.

Introduction

Graviditet er karakteriseret ved tre særskilte immunologiske faser: 1) implantation og tidlig placentation forbundet med en pro-inflammatorisk reaktion (dvs. implantation ligner en "åbent sår"); 2) det andet trimester og det meste af tredje trimester af graviditeten, hvor immun homøostase opnås gennem en overvejende anti-inflammatorisk staten på maternel-føtal interface; og 3) fødsel, en pro-inflammatorisk tilstand ^1-7. Immunceller spiller en vigtig rolle i reguleringen af det inflammatoriske respons ved maternel-føtal grænseflade, hvor deres overflod og lokalisering forandring hele graviditeten ^6-9.

Hos mennesker, den maternelle-føtale grænseflade udgør et område med direkte kontakt mellem moderens (decidua) og føtal (chorion eller trofoblasten) væv. Denne grænseflade omfatter: 1) decidua parietalis at linjer livmoderhulen ikke er omfattet af placenta og er i sammenstillingtil chorion laeve; og 2) decidua basalis, der ligger i rodklumpen af moderkagen, hvor det er invaderet af interstitielle trofoblaster ¹⁰ (figur 1). Intimitet af disse områder af kontakt skaber betingelser for føtal antigen eksponering moderens immunsystem ^11-13. Ikke overraskende leukocytter omfatte op til 30-40% af de moderhindeceller ^8,9,14,15 udover typiske stromale-type celler og kirtelceller ^8,14,16. Rollen af leukocytter på maternel-føtal grænseflade omfatter flere processer, der omfatter begrænsning af trofoblast invasion ^17, ombygning af spiral arterier ^18,19, vedligeholdelse af maternel tolerance ^12,20, og indledning af arbejdskraft ^21-26. Leukocytter af både det adaptive og medfødte lemmer i immunsystemet, dvs. T-celler, makrofager, neutrofiler, B-celler, dendritiske celler og NK-celler, er blevet identificeret i de decidua væv, og deresproportioner og status aktivering har vist sig at variere rumligt og tidsligt hele drægtighedsperioden ^{6-10,12,14,24,27-30.} Forstyrrelser i leukocyt befolkning og / eller funktion er forbundet med spontan abort ^31, præeklampsi ^32, intrauterin vækst begrænsning ^32,33, og for tidlig fødsel ^7,24. Derfor vil undersøgelsen af ​​de fænotypiske egenskaber og funktionalitet af leukocytter på menneskelige maternel-føtal grænseflade lette opklaringen af ​​de immunologiske veje dysreguleret i graviditet lidelser.

En af de mest kraftfulde værktøjer, der anvendes til at bestemme fænotype og funktionelle egenskaber af leukocytter er flowcytometri, teknologi, der tillader kvantitativ analyse af flere parametre samtidigt ^34-36. At analysere leukocytter ved flowcytometri, er isolation af leukocytterne i en enkelt-cellesuspension påkrævet. Derfor, for at en metode adskille infiltrere leukocytes fra maternel-føtal interface er nødvendig for at studere deres fænotypiske og funktionelle egenskaber.

Adskillige metoder er blevet beskrevet at isolere leukocytter fra den humane maternel-føtal grænseflade ^{10,14,25,27,37-39.} Mens nogle anvender mekanisk opdeling ^10,25,27,38, andre bruger enzymatisk fordøjelse ^37,40 for væv dissociation. Fordi mekanisk disaggregering frembringer et lavere udbytte og nedsat levedygtighed ^41, og enzymatisk dissociation kan påvirke levedygtigheden og celleoverflademarkør fastholdelse ^42, den heri beskrevne fremgangsmåde kombinerer forsigtig mekanisk dissociering med enzymatisk forbehandling for at forøge udbyttet af isolerede leukocytter uden at kompromittere cellelevedygtighed. En lignende kombination af metoder er blevet påvist at være effektive til isolering af leukocytter fra decidua væv på maternel-føtal grænseflade ^39. Derfor protokollen beskrevet heri involverer mechanisk opdeling med en automatisk væv dissociator der øger konsistens og samtidig spare tid og arbejdskraft i forhold til traditionelle hakning med modsatrettede skalpeller, barberblade eller kirurgiske sakse ^10,28. Enzymet er valgt til væv dissociation var Accutase. I modsætning til almindeligt anvendte collagenase ^43, dispase ^44, og trypsin ^45, Accutase (en celle løsrivelse opløsning) kombinerer både generel proteolytiske og collagenolytiske aktiviteter, der bidrager til en effektiv endnu blid dissociation ^46,47. Efter dissociation, er leukocytter beriget fra den samlede befolkning i de moderhindeceller ved densitetsgradientcentrifugering. Forskellige densitetsgradient medier er tidligere blevet udnyttet, det mest almindelige er Percoll (en suspension af kolloide silicapartikler) ⁴⁸ og Ficoll (en polymer af saccharose med en høj syntetisk molekylvægt) ^49. Den overlegne effektivitet isolering ved saccharose polymer har været previously vist ^50, og protokollen beskrevne yderligere beviser, at denne densitetsgradient medier giver en tilstrækkelig høj renhed af mononukleære leukocytter.

Derfor protokollen beskrevet heri kombinerer den mekaniske væv disaggregering med en automatisk væv dissociator, enzymatisk behandling med en celle løsrivelse opløsning og leukocyt adskillelse med en densitetsgradient medier (1,077 + 0,001 g / ml) for at isolere leukocytter fra humane decidua væv. Denne protokol er blevet vist at bevare celleoverfladeantigener sammen med cellelevedygtighed. De isolerede leukocytter kan anvendes til flere applikationer, der omfatter immunofænotypebestemmelse med flowcytometri og funktionelle undersøgelser in vitro.

Protocol

Denne protokol er passende for leukocyt isolation fra decidua basalis og decidua parietalis i forberedelse til immunfænotypebestemmelse ved flowcytometri. Endvidere kan de isolerede celler anvendes til cellesortering, cellekultur, RNA-isolering, og cytologi. Før du arbejder med de i denne protokol prøver, skal human etisk godkendelse indhentes fra den lokale Research etiske komité og Institutional Review Boards. Den indsamling og udnyttelse af humane prøver til forskningsformål blev godkendt af Institutional Revie…

Representative Results

. Dissektion af humane væv ved maternel-føtal grænseflade (decidua basalis og decidua parietalis) er vist i figur 1 Denne procedure omfatter dissektion af rodklumpen, som omfatter decidua basalis (figur 1A – D). Decidua basalis opnås ved fjernelse af placenta villi (føtal side) fra rodklumpen (figur 1C). Decidua parietalis opsamles ved forsigtigt at skrabe den chorion membran (figur 1E – F). Figur 2 viser morfologi…

Discussion

Karakterisering af de funktionelle og fænotypiske egenskaber af infiltrerende leukocytter ved den humane maternel-føtal grænseflade er afgørende for forståelsen af ​​de immunmekanismer, der fører til graviditet lidelser. Adskillige teknikker er blevet beskrevet for at isolere leukocytter fra humant maternel-føtal grænseflade hele graviditeten ^{10,14,25,28,37,42,43.} Men hver af disse teknikker er selvstændig, anvender forskellige enzymer eller enzym-kombinationer, kræver forskellige dissociation t…

Materials

			Dissection
Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers	Any vendor	20012-027
1X phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies		(1X PBS)
Large and small Petri dishes	Any vendor
			Dissociation
Accutase	Life Technologies	A11105-01	(cell detachment solution)
Sterile 2 mL safe-lock conical tubes	Any vendor
50 mL conical centrifuge tubes	Any vendor
100 µm cell strainers	FALCON/Corning	352360
5 mL round bottom polystyrene test tubes	Any vendor
Transfer pipettes	Any vendor
C tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
			Cell Culture
RPMI culture medium 1640	Life Technologies	22400-089	(1X) (10% FBS and 1% P/S)
Plastic chamber slides	Thermo Scientific	177437
Incubator	Thermo Scientific Corporation	HEPA Class 100
Water bath	Fisher Scientific	ISOTEMP 110
Cell counter	Nexelcom	Cellometer Auto2000
Microscope	Olympus	Olympus CKX41
			Cell Separation
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Cell separator	Miltenyi Biotec	130-042-109
30μm pre-separation filters	Miltenyi Biotec	130-041-40
Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
15mL safe-lock conical tubes	Any Vendor
MACS buffer			(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)
			Reagents
FcR Blocking	Miltenyi Biotec	130-059-901	(Fc Block)
Anti-human cell surface antigen antibodies	BD Biosciences		(Table 1)
Bovine serum albumin	Sigma	A7906
LIVE/DEAD viability dye	BD Biosciences	564406
Lyse/Fix buffer	BD Biosciences	346202
FACS buffer			(1% BSA, 0.5% Sodium Azide, and 1X PBS)
Staining buffer	BD Biosciences	554656
Trypan Blue solution 0.4%	Life Technologies	15250-011
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	20% density gradient media
			Additional Instruments
Incubator with shaker	Thermo Scientific	MAXQ 4450
Flow cytometer	BD Biosciences	LSR-Fortessa
Centrifuge	Beckman Coulter	SpinChron DLX
Vacuum system	Any vendor
Automatic tissue dissociator	Miltenyi Biotec	gentleMACS Dissociator