인간의 산모 - 태아 인터페이스에서 백혈구의 분리
Summary
Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis – the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.
Abstract
임신은 생식 조직과 모성 – 태아 인터페이스에서 백혈구 (탈락의 basalis과 탈락의 parietalis)의 침윤을 특징으로한다. 이 인터페이스는 산모와 태아 조직 사이의 접촉의 해부학 적 위치이다; 따라서, 임신 동안 작업의 면역 사이트이다. 산모 – 태아 인터페이스에서의 침투 백혈구는 전달의 중심 주입 역할, 임신의 유지 보수 및 타이밍을한다. 따라서 이러한 백혈구의 표현형 및 기능 특성화 임신 장애로 이어질 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 것입니다. 몇몇 프로토콜들은 탈락의 basalis 및 탈락의 parietalis로부터 백혈구 침윤 분리하기 위해 설명되었다; 그러나, 배양 시약, 효소, 및 시간에서의 일관성 결여 어려운 이들 결과를 비교한다. 본원에 기재된 부드러운 기계적 및 효소 DISS의 사용을 겸비한 신규 한 접근법ociation 기술 모체 – 태아의 계면에서의 인간 조직에서 분리 된 백혈구 세포 및 세포 마커의 생존과 무결성을 보존한다. 제외하고 모두 면역, 세포 배양, 세포 분류에서,이 프로토콜의 미래 응용 프로그램은 많고 다양하다. 이 프로토콜에 따라, 절연 백혈구 DNA를 시험 관내 백혈구 기능 (즉, 식세포 작용, 세포 독성 T 세포 증식 및 가소성 등)에 메틸화, 표적 유전자의 발현 및 활성 산소 종의 생성을 결정하는데 사용될 수있다 산모 – 태아 인터페이스에서. 또한, 설명 된 프로토콜을 사용하여,이 연구소는 산모 – 태아 인터페이스에서 새로운 희귀 백혈구를 설명 할 수있다.
Introduction
임신은 세 가지 면역 학적 상 특징 : 1) 주입 및 프로 – 염증 반응과 관련된 초기 태반이 (즉, 주입은 '열린 상처'과 유사) 2) 두 번째 임신과 면역 항상성이 산모 – 태아 인터페이스에서 주로 항 염증 상태를 통해 달성 임신의 세 번째 임신의 대부분; 3) 분만, 염증성 상태 1-7. 면역 세포는 모체 – 태아의 계면에서 염증 반응을 조절하는데 중요한 역할을하는 곳들이 풍부 임신 6-9 걸쳐 파악 변화.
인간으로, 산모 – 태아 인터페이스는 모성 (탈락) 태아 (융모막 또는 영양막 세포) 조직 사이의 직접 접촉의 영역을 나타냅니다. 1) 탈락 선 자궁강이 태반에 포함하지 않는 것이 parietalis과 병렬 인 :이 인터페이스는 포함융모막의 laeve에; 2)이 침입 trophoblasts (10) (그림 1)에 의해 침략하는 태반의 기초 판에있는 탈락의 basalis. 접촉이 지역의 친밀감은 산모의 면역 체계 11-13에 태아 항원 노출에 대한 조건을 만듭니다. 당연히 백혈구 전형적인 기질 형 세포 및 세포 선의 8,14,16 이외에 탈락 세포 8,9,14,15 30-40 %까지 포함한다. 산모 – 태아 인터페이스에서 백혈구의 역할은 영양막 세포의 침윤 (17)의 제한, 나선형 동맥 (18, 19)의 리모델링, 어머니의 허용 오차 12, 20의 유지 보수 및 노동 21-26의 개시를 포함하는 여러 프로세스를 포함한다. 적응 및 즉, T 세포, 대 식세포, 호중구, B 세포, 수지상 세포 및 NK 세포, 탈락 막 조직에서 확인되었다 면역계의 타고난 사지, 그 양의 백혈구비율 및 활성화 상태는 임신 6-10,12,14,24,27-30 걸쳐 공간적 및 시간적으로 변화시키는 것으로 나타났다. 백혈구 인구 및 / 또는 기능의 교란은 자연 유산 (31), 자간전증 (32), 자궁 내 성장 제한 32, 33, 및 조산 7,24과 연결되어 있습니다. 따라서, 인간의 모체 – 태아의 계면에서의 표현형 특성과 백혈구의 기능에 대한 연구는 임신 장애의 조절 곤란 면역 학적 경로의 해명을 촉진 할 것이다.
여러 매개 변수를 동시에 34 ~ 36의 정량 분석을 할 수 있습니다 유동 세포 계측법 된 표현형과 백혈구의 기능적 특성을 결정하는 데 사용되는 가장 강력한 도구 중 하나, 기술. 유동 세포 계측법에 의한 백혈구를 분석하기 위해, 단일 세포 현탁액 내의 백혈구의 분리가 필요하다. 따라서, 방법은 레 침투 분리하는산모 – 태아 인터페이스에서 kocytes들은 표현형 및 기능적 특성을 연구하기 위해 필요합니다.
몇 가지 방법이 인간 모체 – 태아 인터페이스 10,14,25,27,37-39로부터 백혈구를 분리하는 기술되었다. 일부는 기계 세분화 10,25,27,38을 적용하는 동안, 다른 사람은 조직 분리에 대한 효소 소화 37,40를 사용합니다. 기계적인 세분화가 낮은 수율 및 감소 된 생존 41과 생존 세포 표면 마커 보유 42에 영향을 미칠 수있는 효소 적 분해를 생성하기 때문에, 본원에 기재된 방법은 세포 생존을 손상시키지 않고 절연 백혈구의 수율을 증가시키는 효소 전처리와 부드러운 기계적 해리를 결합한다. 방법의 유사한 조합이 모체 – 태아의 인터페이스 (39)에서 탈락 조직으로부터 백혈구 분리에 효과적인 것으로 입증되었다. 따라서, 본 명세서에 설명 된 프로토콜을 포함 메카반대 메스, 면도날, 또는 수술 가위 10,28 전통 닦지에 비해 시간과 노동을 절약하면서 일관성을 증가시키는 자동 조직 dissociator와 nical 세분화. 티슈 해리를 위해 선택된 효소 Accutase이었다. 일반적으로 사용되는 43 콜라게나 제와는 달리, 44 디스 파제, 트립신 45 Accutase (세포 분리 용액)을 일반적으로 단백질 가수 분해하고 효율적인 아직 부드러운 (46, 47)의 해리에 기여 collagenolytic 활동 모두를 결합한다. 분리 후, 백혈구는 밀도 구배 원심 분리에 의해 탈락 막 세포의 전체 인구에서 농축된다. 각종 밀도 구배 매체는 이전 퍼콜 (콜로 이달 실리카 입자의 현탁액) (48) 및 피콜 (합성 고 분자량의 중합체 자당) (49)이다 가장 일반적인 그중, 이용되어왔다. 크로스 폴리머에 의한 분리의 우수한 효율 previo있다usly 50를 도시하고, 본 명세서에서 더 설명 프로토콜이 밀도 구배 매체 단핵구의 충분히 높은 순도를 생산하고 있음을 증명한다.
따라서, 본원에 기재된 프로토콜은 인간 탈락 조직으로부터 백혈구를 분리하는 밀도 구배 매체 (1.077 + 0.001 g / mL)로 자동 티슈 dissociator, 세포 분리 용액과 소화 효소, 백혈구 분리하여 기계적 조직의 세분화를 결합한다. 이 프로토콜은 세포 생존과 함께 세포 표면 항원을 유지하는 입증되었다. 고립 된 백혈구는 유동 세포 계측법 및 체외에서 기능 연구와 면역 표현형을 포함 여러 애플리케이션에 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
인간의 산모 – 태아 인터페이스에서 백혈구 침투의 기능 및 표현형 특성의 특성은 임신 장애로 이어질 면역 메커니즘의 이해에 필수적이다. 몇 가지 기술은 임신 10,14,25,28,37,42,43에 걸쳐 인간의 모체 – 태아 인터페이스로부터 백혈구를 분리하기 위해 설명되었다. 그러나, 이들 기술들의 각각은 별개 항상 분리 된 세포의 생존 능력을 지정하지 않고, 가장 중요한 것은, 효소 또는 효소 결합 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 아동 건강 및 인간 발달의 유니스 케네디 슈라이버 국립 연구소, NIH / DHHS에 의해 지원되었다. 이 작품은 또한 모자, 주 산기 모자 건강에 웨인 주립 대학 주 산기 이니셔티브에 의해 부분적으로 지원되었다. 우리는 기꺼이 원고의 그녀의 중요한 측정 값에 대한 모린 McGerty (웨인 주립 대학)을 인정합니다.
Materials
| Dissection | |||
| Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers | Any vendor | 20012-027 | |
| 1X phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | (1X PBS) | |
| Large and small Petri dishes | Any vendor | ||
| Dissociation | |||
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | (cell detachment solution) |
| Sterile 2 mL safe-lock conical tubes | Any vendor | ||
| 50 mL conical centrifuge tubes | Any vendor | ||
| 100 µm cell strainers | FALCON/Corning | 352360 | |
| 5 mL round bottom polystyrene test tubes | Any vendor | ||
| Transfer pipettes | Any vendor | ||
| C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Cell Culture | |||
| RPMI culture medium 1640 | Life Technologies | 22400-089 | (1X) (10% FBS and 1% P/S) |
| Plastic chamber slides | Thermo Scientific | 177437 | |
| Incubator | Thermo Scientific Corporation | HEPA Class 100 | |
| Water bath | Fisher Scientific | ISOTEMP 110 | |
| Cell counter | Nexelcom | Cellometer Auto2000 | |
| Microscope | Olympus | Olympus CKX41 | |
| Cell Separation | |||
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Cell separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| 30μm pre-separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-40 | |
| Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 15mL safe-lock conical tubes | Any Vendor | ||
| MACS buffer | (0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS) | ||
| Reagents | |||
| FcR Blocking | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | (Fc Block) |
| Anti-human cell surface antigen antibodies | BD Biosciences | (Table 1) | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| LIVE/DEAD viability dye | BD Biosciences | 564406 | |
| Lyse/Fix buffer | BD Biosciences | 346202 | |
| FACS buffer | (1% BSA, 0.5% Sodium Azide, and 1X PBS) | ||
| Staining buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| Trypan Blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250-011 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | 20% density gradient media |
| Additional Instruments | |||
| Incubator with shaker | Thermo Scientific | MAXQ 4450 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSR-Fortessa | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | SpinChron DLX | |
| Vacuum system | Any vendor | ||
| Automatic tissue dissociator | Miltenyi Biotec | gentleMACS Dissociator |
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