Создание клинически значимых<em> Экс Vivo</em> Мок хирургии катаракты модель для исследования Эпителиальный заживления раны в родной микроокружения

Summary

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

Abstract

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells’ native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens¹. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Introduction

Клинически значимых, макет хирургии катаракты, экс естественных эпителиальных ранозаживляющее модель, описанная здесь была разработана, чтобы предоставить инструмент для исследования механизмов, которые регулируют ремонт эпителиальных тканей в ответ на повреждение. Основные функции, которые были направлены на создание в этой модели включены 1) обеспечение условий, которые тесно повторены ответ в естественных условиях на ранив в условиях культуры, 2) простота модуляции регуляторные элементы ремонта, и 3) способность к изображению процесс ремонта, в полном объеме, в режиме реального времени. Таким образом, задача в том, чтобы создать модель культуры, в которой можно было учиться, и манипулировать, эпителиальных ремонт раны в родном микросреды клеток. Наличие этой раны ремонта модели открывает новые возможности для идентификации эндогенных реплики сигнализации от матричных белков, цитокинов и хемокинов, которые регулируют процесс восстановления. Кроме того, модель идеально подходит для изучения того, какп эпителий способен двигаться как коллективная листа повторно epithelialize рану площадь ^2,3, а для определения происхождение лидера мезенхимальных клеток в края раны, что функционировать в управлении коллективной миграции потерпевшей эпителия ^4. Эта модель также предоставляет платформу, с которой, чтобы определить терапевтические средства, которые могли бы способствовать эффективному заживлению ран и предотвращению аномальным раны ремонт ^5.

Есть уже ряд доступных моделей раны ремонт, и в культуре, и в естественных условиях, которые предоставили большую часть того, что известно о процессе заживления раны сегодня. В моделях на животных травмы, такие как роговицы и кожи ^{6-12 13-17,} есть возможность изучать реакцию ткани ранив в контексте всех ремонтных посредников, которые могли бы быть вовлечены в процесс, в том числе взносов сосудистая и нервная система. Тем не менее, существуют ограничения на манипуляции экспериментовпсихические состояния в естественных условиях, и это пока не представляется возможным провести исследования изображений отклика ремонт в естественных условиях, непрерывно в течение времени. В противоположность этому, большинство в пробирке с раной ремонт модели культуры, такие как царапины раны, можно легко манипулировать, и последующим течением времени, но не хватает на окружающую контексте изучения заживления ран в ткани в естественных условиях. В то время как исключая виво модели имеют преимущество в изучении процесса ремонта повреждений непрерывно в течение времени в контексте микроокружения клеток в сочетании со способностью модулировать регуляторов молекулярной ремонта в любой момент времени в процессе, есть несколько моделей, которые соответствуют этим Параметры.

Здесь описан порядок генерировать высоко воспроизводимое Экс Vivo эпителиальных ранозаживляющее культур, которые воспроизводят ответ эпителиального ткани в к физиологической ранения. Использование куриных эмбрионов объектив в качестве источника ткани, экс естественных MOCК хирургии катаракты проводится. Объектив идеально подходит ткань использовать для этих исследований, так как он является самодостаточным в толстой базальной мембраны капсулы, асептический, не иннервируются, и без каких-либо связанного стромы ^18,19. В болезни человека, хирургия катаракты обращается к потере зрения из-за помутнение хрусталика, и включает в себя удаление клеточной массы линзы волокна, который включает большую часть объектива. После хирургии катаракты зрение восстанавливается путем включения искусственного хрусталика. Процедура хирургии катаракты, за счет удаления волокон клеток, индуцирует ответ травмы в соседнем линзы эпителия, который отвечает реэпителизацию заднего области капсулы хрусталика, которые были заняты клеток волокон. В хирургии катаракты, как и в большинстве ответов заживления ран, там иногда происходит аберрантный фиброзной исход в заживления ран ответ, связанный с появлением миофибробластов, что в объектив известного как Posterior Capsuле Помутнение ^20-22. Для создания хирургии катаракты заживление ран модель, процедура хирургии катаракты имитируется в линзах удалены из куриного эмбриона глаза, чтобы произвести физиологическое травмы. Микрохирургические удаление объектива волоконно клеток приводит в очень состоятельной зоне круговой раны в окружении объектив эпителиальных клеток. Это популяция клеток остается прочно прикреплены к мембраны капсулы линзы подвал и пострадал от хирургического вмешательства. Эпителиальные клетки мигрируют на обнаженную область эндогенного базальной мембраны, чтобы залечить раны, во главе с населением виментина богатых мезенхимальных клеток, известных в процессе ремонта, как лидер клеток ^1. С помощью этой модели реакция эпителия на повреждение можно легко визуализировать и последующим со временем в контексте микроокружения клеток. Клетки были легко доступны для модификации экспрессии или активации молекул ожидается, будет играть роль в заживлении ран. Мощная функция гоэто модель способность изолировать и изучать миграции конкретных изменений в рамках заживления ран. Возможность подготовки большого числа в возрасте подобранных бывших естественных условиях заживления ран культур для исследований является еще одним преимуществом этой модели. Таким образом, эта модель системы дает уникальную возможность дразнить друг от друга механизмы заживления ран и тестирования терапии для их влияния на процесс заживления ран. Экс естественных макет модель хирургии катаракты, как ожидается, широкое применение, обеспечивая критический ресурс для изучения механизмов ремонта повреждений.

Protocol

Следующий протокол соответствует руководящим принципам Уходу за животными и использование комитета Университете Томаса Джефферсона и заявления ARVO для использования животных в Vision Research. 1. Установка и подготовка Объективы для экс Vivo ран культуры Поместите т?…

Representative Results

Создано Экс Vivo Модель для изучения процесса заживления ран на родном микросреды клеток Чтобы исследовать механизмы, участвующие в регуляции заживления эпителия в родном микросреды клеток, клинически значимых экс естественных макет модель хирургии катаракты…

Discussion

Here is described a technique for preparing a culture model of wound repair that involves performing an ex vivo cataract surgery on chick embryo lenses after their removal from the eye. The lens epithelium responds to this clinically relevant wounding with a repair process that closely mimics that which occurs in vivo, and shares features with wound repair in other epithelial tissues^2,4. While the protocol is straightforward and simple to follow, performing mock cataract surgery with embryoni…

Materials

Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S271-3	Use at 140mM in TD Buffer
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	P217-500	Use at 5mM in TD Buffer
Sodium Phosphate (Na2HPO4)	Sigma	S0876	Use at .7mM in TD Buffer
D-glucose (Dextrose)	Fisher Scientific	D16-500	Use at 0.5mM in TD Buffer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-1	Use at 8.25mM in TD Buffer
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144-500	Use to pH TD buffer to 7.4
Media 199	GIBCO	11150-059
L-glutamine	Corning/CellGro	25-005-CI	Use at 1% in Media199
Penicillin/streptomycin	Corning/CellGro	30-002-CI	Use at 1% in Media199
100mm petri dishes	Fisher Scientific	FB0875711Z
Stericup Filter Unit	Millipore	SCGPU01RE	Use to filter sterilize Media
Dumont #5 forceps (need 2)	Fine Science Tools	11251-20
35mm Cell Culture Dish	Corning	430165
27 Gauge 1mL SlipTip with precision glide needle	BD	309623
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Standard Forceps	Fine Science Tools	91100-12
Other Items Needed: General dissection instruments,  fertile white leghorn chicken eggs,
check egg incubator (humidified, 37.7°C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting
microscope