Inrättande av en kliniskt relevant<em> Ex vivo</em> Mock kataraktoperation Modell för utredning Epithelial sårläkning i en Native mikromiljö

Summary

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

Abstract

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells’ native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens¹. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Introduction

Den kliniskt relevant, mock kataraktkirurgi, var ex vivo epitelial sårläkning modell som beskrivs här utvecklats för att ge ett verktyg för att undersöka de mekanismer som reglerar reparation av epitelvävnader som svar på en skada. Viktiga funktioner som syftade till att skapa denna modell ingår 1) ger förutsättningar som är nära replikerade svaret in vivo såra i en kultur miljö, 2) underlätta att modulera de regulatoriska elementen av reparation, och 3) förmåga att avbilda reparationsprocessen, i sin helhet, i realtid. Utmaningen var därför att skapa en kultur modell där det var möjligt att studera och manipulera, epitel sårläkning i cellernas infödda mikro. Tillgängligheten av detta sår-reparation modell öppnar nya möjligheter för att identifiera de endogena signal signaler från matrixproteiner, cytokiner och kemokiner som reglerar reparationsprocessen. Dessutom är modellen idealisk för att undersöka hur enn epitel kan röra sig som en kollektiv ark att åter epithelialize sårområdet ^2,3, och för att bestämma linjen av mesenkymala ledare celler vid sårkanten som fungerar för att styra den kollektiva migration av de skadade epitel ^4. Denna modell ger också en plattform som man kan identifiera läkemedel som kan främja en effektiv sårläkning och förhindra avvikande sårläkning ^5.

Det finns redan ett antal tillgängliga sår-reparation modeller, både i kultur och in vivo, som har lämnat det mesta av vad som är känt om såret reparationsprocessen idag. I djurskademodeller, såsom hornhinnan ^6-12 och hud ^13-17, finns det möjlighet att studera svaret från vävnaden att såra i samband med alla reparations medlare som kan vara inblandade i processen, inklusive bidrag från kärl och nervsystemet. Det finns dock begränsningar för att manipulera erfapsykiska tillstånd in vivo, och det är ännu inte möjligt att genomföra imaging studier av reparationssvar in vivo kontinuerligt över tiden. Däremot flesta in vitro-sår-reparation kulturmodeller, såsom scratch såret, lätt kan manipuleras och följas över tiden men saknar miljösammanhang att studera sårläkning i in vivo-vävnaden. Medan ex vivo-modeller har fördelen att studera skadereparationsprocessen kontinuerligt över tiden inom ramen för cellernas mikromiljö i kombination med förmågan att modulera de molekylära regulatorer av reparation vid någon tidpunkt i processen, det finns några modeller som passar dessa parametrar.

Här beskrivs ett förfarande för att generera mycket reproducerbar ex vivo epitelial sårläknings kulturer som reproducerar en epitelvävnad svar på en fysiologisk sårande. Använda kycklingembryo linsen som en vävnadskälla, en ex vivo mock kataraktkirurgi utförs. Linsen är en idealisk vävnad som ska användas för dessa studier, eftersom det är självinnesluten i en tjock basmembran kapsel, avaskulär inte innerveras, och fri från tillhörande stroma ^18,19. I den humana sjukdomen, adresserar kataraktkirurgi synförlust på grund av grumling av linsen, och innebär avlägsnande av linsfibercellmassa, vilken innefattar huvuddelen av linsen. Efter kataraktkirurgi vision återställdes genom infogning av en artificiell intraokulär lins. Den kataraktkirurgi förfarande, genom avlägsnande av fiberceller, inducerar en skada svar i den intilliggande lins epitel, som svarar genom att återpitelisering av den bakre delen av linskapseln som hade ockuperats av fiberceller. I kataraktkirurgi, som i de flesta sårläkning svar, ibland sker det en avvikande fibrotisk resultat av sårläknings svar, i samband med framväxten av myofibroblaster, som i linsen kallas posterior Capsule opacifiering ^20-22. För att generera kataraktkirurgi sårläkning modell är en kataraktkirurgi förfarande härmade i linser bort från kycklingembryo ögat för att producera en fysiologisk skada. Mikro borttagning av linsfiberceller resulterar i en mycket konsekvent cirkulärt sår område omgivet av linsepitelceller. Denna cellpopulation förblir stadigt fäst linsbasalmembranet kapseln och skadas av det kirurgiska ingreppet. De epitelceller migrerar på blottlagda delen av endogena basalmembranet att läka såret, som leds av en population av vimentin rika mesenkymala celler är kända inom reparationsprocessen som ledare celler ^1. Med denna modell svaret hos ett epitel på skada kan lätt visualiseras och följes med tiden i samband med cellernas mikromiljö. Cellerna är lätt tillgängliga för modifieringar av expression eller aktivering av molekyler som förväntas spela en roll i sårläkning. En kraftfull funktion i thär modell är förmågan att isolera och studera migration specifika förändringar inom ramen för sårläkning. Förmågan att framställa stora antal åldrade matchade ex vivo sårläknings odlingar för studier är en annan fördel med denna modell. Således tillhandahåller denna modell systemet en unik möjlighet att retas isär mekanismer för sårläkning och test läkemedel för deras effekt på såret läkningsprocessen. Den ex vivo mock kataraktkirurgi modellen förväntas ha bred användbarhet, vilket ger en kritisk resurs för att studera mekanismer för skada reparation.

Protocol

Följande protokoll uppfyller Thomas Jefferson University Institutional Animal Care och användning kommittén riktlinjer och med Arvo uttalande för användning av djur i Vision Research. 1. Inställning och framställning av linser för ex vivo Wound Kultur Placera tre 100 mm petriskålar i en steril, laminärt flöde huva. Fyll två av de petriskålar halvvägs med Tris / dextros-buffert (TD-buffert; 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,7 mM Na 2 PO 4, 5 mM D…

Representative Results

Ex vivo-modell som skapats för att studera sårläkningsprocessen i cellernas infödda mikro För att undersöka mekanismer som är involverade i regleringen av sårläkning av en epitel inom cellernas infödda mikro, var ett kliniskt relevant ex vivo mock kataraktoperation modell skapas. Denna modell är skapad från linsvävnad som erbjuder många fördelar på grund av dess inneboende egenskaper: 1) Objektivet är ett fristående organ som omges av en tjock basmembran k…

Discussion

Here is described a technique for preparing a culture model of wound repair that involves performing an ex vivo cataract surgery on chick embryo lenses after their removal from the eye. The lens epithelium responds to this clinically relevant wounding with a repair process that closely mimics that which occurs in vivo, and shares features with wound repair in other epithelial tissues^2,4. While the protocol is straightforward and simple to follow, performing mock cataract surgery with embryoni…

Materials

Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S271-3	Use at 140mM in TD Buffer
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	P217-500	Use at 5mM in TD Buffer
Sodium Phosphate (Na2HPO4)	Sigma	S0876	Use at .7mM in TD Buffer
D-glucose (Dextrose)	Fisher Scientific	D16-500	Use at 0.5mM in TD Buffer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-1	Use at 8.25mM in TD Buffer
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144-500	Use to pH TD buffer to 7.4
Media 199	GIBCO	11150-059
L-glutamine	Corning/CellGro	25-005-CI	Use at 1% in Media199
Penicillin/streptomycin	Corning/CellGro	30-002-CI	Use at 1% in Media199
100mm petri dishes	Fisher Scientific	FB0875711Z
Stericup Filter Unit	Millipore	SCGPU01RE	Use to filter sterilize Media
Dumont #5 forceps (need 2)	Fine Science Tools	11251-20
35mm Cell Culture Dish	Corning	430165
27 Gauge 1mL SlipTip with precision glide needle	BD	309623
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Standard Forceps	Fine Science Tools	91100-12
Other Items Needed: General dissection instruments,  fertile white leghorn chicken eggs,
check egg incubator (humidified, 37.7°C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting
microscope