Oprichting van een klinisch relevante<em> Ex Vivo</em> Mock Cataract Surgery model voor het onderzoeken van Epithelial Wound Repair in een Inheems Microenvironment

Summary

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

Abstract

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells’ native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens¹. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Introduction

De klinisch significante, mock staaroperatie, ex vivo epitheliale wondgenezing model beschreven is ontwikkeld om een instrument voor het onderzoeken van de mechanismen die de reparatie van epitheelweefsels regelen in respons op een verwonding verschaffen. Belangrijkste voordelen die werden nagestreefd bij het ​​creëren van deze model inbegrepen 1) het verschaffen van omstandigheden die nauw gerepliceerd in vivo respons op verwonding in een kweek, 2) gemak van het moduleren van de regulerende elementen van de reparatie, en 3) het vermogen om het beeld reparatieproces in zijn geheel, in real time. De uitdaging was daarom een ​​cultuurmodel waarin mogelijke was studeren creëren en manipuleren epitheliale wondheling in natieve micro de cellen. De beschikbaarheid van deze wond-repair model opent nieuwe mogelijkheden voor de identificatie van de endogene signalen signalen van matrixeiwitten, cytokines en chemokines dat het reparatieproces te regelen. Bovendien is het model geschikt voor het onderzoeken hoe eenn epitheel kan bewegen als collectief vel opnieuw epithelium aan het wondgebied ^2,3, en voor het bepalen van het geslacht van mesenchymale cellen leider aan de wondrand die functioneren richten van de collectieve migratie van epitheel ⁴ gewonden. Dit model verschaft een platform waarmee therapeutische doeltreffende wondgenezing kan bevorderen en de afwijkende wondheling ⁵ identificeren.

Er zijn al een aantal beschikbare wond-reparatie modellen, zowel in de cultuur en in vivo, waarin het grootste deel van wat bekend is over de wond reparatieproces vandaag hebben geleverd. In dierlijke modellen letsel, zoals cornea ^6-12 en ^13-17 huid, is er de mogelijkheid om de reactie van het weefsel te bestuderen verwonding in het kader van de reparatie mediatoren die betrokken kan zijn bij het ​​proces, en de bijdragen van de vaatstelsel en het zenuwstelsel. Er zijn echter beperkingen aan het manipuleren van de experimentale aandoeningen in vivo, en het is nog niet mogelijk imaging studies verrichten van reparaties respons in vivo continu in de tijd. Daarentegen zijn de meeste in vitro opgewikkelde reparatie cultuurmodellen, zoals scratch wond, kan gemakkelijk worden gemanipuleerd en tijd gevolgd maar missen de omgevingscontext bestuderen wondheling in het in vivo weefsel. Terwijl ex vivo modellen bieden het voordeel van het bestuderen van de schade reparatieproces continu in de tijd in verband met micro de cellen gekoppeld aan het vermogen om de moleculaire regulatoren van de reparatie te moduleren op enig tijdstip in het proces, zijn er weinig modellen die deze passen parameters.

Hier wordt beschreven een werkwijze om zeer reproduceerbare ex vivo epitheliale wondgenezing culturen die reactie van een epitheliaal weefsel van een fysiologische verwonding reproduceren genereren. Met behulp van de kippenembryo lens als een tissue bron, een ex vivo mock cataract operatie wordt uitgevoerd. De lens is een ideale weefsel te gebruiken voor deze studies aangezien het self-contained binnen een dikke basaal membraan capsule, avasculaire, niet geïnnerveerd, en vrij van eventuele bijbehorende stroma ^18,19. In de menselijke ziekte, cataractchirurgie richt gezichtsverlies vanwege vertroebeling van de lens, en omvat het verwijderen van de lensvezel celmassa, die het grootste deel van de lens omvat. Na cataractchirurgie zicht wordt hersteld door het inbrengen van een kunstmatige intraoculaire lens. De cataract chirurgische procedure door het verwijderen van vezels cellen induceert een verwonding respons in de aangrenzende lensepitheel, die reageert door re-epithelisatie van het achterste gebied van het lenskapsel dat bezet was door de vezel cellen. In cataract chirurgie, zoals in de meeste wondheling respons treedt er soms een afwijkende fibrotische resultaat van de wondgenezingsreactie, op de opkomst van myofibroblasten, die bekend is in het lens Posterior Capsule Ondoorzichtig ^20-22. Om de staaroperatie wondgenezing model te genereren, is een staaroperatie procedure nagebootst in lenzen verwijderd uit het kippenembryo oog op een fysiologische letsel te produceren. Microchirurgische verwijdering van lensvezel cellen resulteert in een zeer constante cirkelvormige wond midden van de lens epitheelcellen. Deze cel populatie blijft stevig aan de lens basaal membraan capsule en wordt verwond door de chirurgische procedure. De epitheliale cellen migreren naar de Denuded gebied van de endogene basale membraan naar de wond, onder leiding van een populatie van vimentine rijk mesenchymale cellen in het reparatieproces zogenaamde leader cellen ¹ genezen. Met dit model kunnen de respons van een epithelium om schade eenvoudig kunnen worden gevisualiseerd gevolgd met de tijd in de context van de micro cellen. De cellen kunnen worden geraadpleegd door wijziging van de expressie of activatie van moleculen verwachting een rol spelen in wondheling. Een krachtige eigenschap van this model is de mogelijkheid te isoleren en studiemigratie-specifieke veranderingen in het kader van wondgenezing. Het vermogen om grote aantallen voldoen ex vivo kweken wondgenezende leeftijd bereiden studies is een ander voordeel van dit model. Zo, dit modelsysteem biedt een unieke gelegenheid om te plagen elkaar mechanismen van wondheling en test therapeutica voor hun effect op de wondgenezing proces. De ex vivo mock staaroperatie model zal naar verwachting brede toepasbaarheid hebben, die een cruciale bron voor het bestuderen van mechanismen van letsel reparatie.

Protocol

Het volgende protocol voldoet aan de Thomas Jefferson University Institutional Animal Care en gebruik Comite richtlijnen en met de ARVO verklaring voor het gebruik van dieren in Vision Research. 1. Setup en voorbereiding van Lenzen voor Ex Vivo Wound Cultuur Plaats drie 100 mm petrischalen in een steriele laminaire stroming kap. Vul twee petrischalen helft met Tris / Dextrose buffer (TD buffer; 140 mM NaCl, 5 mM KCI, 0,7 mM Na 2PO 4, 5 mM D-glucose, 8,25 mM Tri…

Representative Results

Ex Vivo model gemaakt om de wond genezingsproces studeren in inheemse micro-omgeving van de cellen ' Om de mechanismen die betrokken zijn bij het ​​reguleren van wondheling van een epitheel binnen inheemse micro de cellen 'te onderzoeken, werd een klinisch relevante ex vivo mock staaroperatie model gecreëerd. Dit model is gemaakt van lensdoek biedt vele voordelen vanwege zijn intrinsieke eigenschappen: 1) de lens een onafhankelijk orgaan omgeven met dichte basa…

Discussion

Here is described a technique for preparing a culture model of wound repair that involves performing an ex vivo cataract surgery on chick embryo lenses after their removal from the eye. The lens epithelium responds to this clinically relevant wounding with a repair process that closely mimics that which occurs in vivo, and shares features with wound repair in other epithelial tissues^2,4. While the protocol is straightforward and simple to follow, performing mock cataract surgery with embryoni…

Materials

Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S271-3	Use at 140mM in TD Buffer
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	P217-500	Use at 5mM in TD Buffer
Sodium Phosphate (Na2HPO4)	Sigma	S0876	Use at .7mM in TD Buffer
D-glucose (Dextrose)	Fisher Scientific	D16-500	Use at 0.5mM in TD Buffer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-1	Use at 8.25mM in TD Buffer
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144-500	Use to pH TD buffer to 7.4
Media 199	GIBCO	11150-059
L-glutamine	Corning/CellGro	25-005-CI	Use at 1% in Media199
Penicillin/streptomycin	Corning/CellGro	30-002-CI	Use at 1% in Media199
100mm petri dishes	Fisher Scientific	FB0875711Z
Stericup Filter Unit	Millipore	SCGPU01RE	Use to filter sterilize Media
Dumont #5 forceps (need 2)	Fine Science Tools	11251-20
35mm Cell Culture Dish	Corning	430165
27 Gauge 1mL SlipTip with precision glide needle	BD	309623
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Standard Forceps	Fine Science Tools	91100-12
Other Items Needed: General dissection instruments,  fertile white leghorn chicken eggs,
check egg incubator (humidified, 37.7°C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting
microscope