Eenvoudige Bulk uitlezing van Digital nucleïnezuur kwantificering Testen
Summary
We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.
Abstract
Digitale assays zijn krachtige werkwijzen die detectie van zeldzame cellen en telling van individuele nucleïnezuurmoleculen mogelijk. Echter, digitale assays nog niet routinematig toegepast, vanwege de kosten en de specifieke uitrusting geassocieerd met commercieel beschikbare methoden. Hier presenteren we een vereenvoudigde werkwijze voor het uitlezen van digitale druppel assays met een gebruikelijke real-time PCR-instrument om fluorescentie van bulk-droplet gebaseerde digitale assays meten.
We karakteriseren van de prestaties van de bulk uitlezing assay met behulp van synthetische droplet mengsels en een druppel digitale multiple verplaatsing amplificatie (MDA) assay. Kwantitatieve MDA vooral voordelen van een digitale reactie formaat, maar onze nieuwe methode is van toepassing op elke digitale test. Voor gevestigde digitale testprotocollen zoals digitale PCR methode dient te versnellen en te vereenvoudigen assay uitlezing.
Onze bulk uitlezing methode brengt de voordelen van partitioned assays zonder de behoefte aan gespecialiseerde uitlezing instrumentatie. De voornaamste beperkingen van de bulk uitlezing methode worden gereduceerd dynamisch bereik in vergelijking met druppel-telling platforms en de noodzaak van een standaardmonster, hoewel de vereisten voor deze standaard zijn minder veeleisend dan bij conventionele real-time experiment. Kwantitatieve gehele genoom amplificatie (WGA) wordt gebruikt om te testen op verontreinigingen in WGA reacties en is de meest gevoelige manier om de aanwezigheid van DNA-fragmenten met onbekende sequenties te detecteren, waardoor de werkwijze grote belofte in diverse toepassingsgebieden zoals farmaceutische kwaliteitscontrole en astrobiology.
Introduction
Digitale assays voor nucleïnezuur kwantificatie (digitale PCR) 1-4 en de basis orde (sequencing) sterk beïnvloeden de life sciences en de geneeskunde. Digitale testen leveren kwantificering van moleculaire rekent op een absolute schaal (niet ten opzichte van een controle), het verstrekken van hoge gevoeligheid, waardoor gemakkelijke vergelijkingen tussen experimenten, en cruciaal, zodat de bouw van grote databases met vergelijkbare gegevens 5 (tabel 1).
In de afgelopen 15 jaar, hele genoom amplificatie (WGA) ontstond naast PCR als een algemeen hulpmiddel voor nucleïnezuuramplificatie. Zoals PCR, WGA nuttig voor analytische en preparatieve toepassingen door amplificatie minuut steekproefelementen tot een niveau dat gemakkelijk kan worden gedetecteerd of gebruikt voor verdere analysen achtige basis sequencing. In tegenstelling tot PCR, WGA is niet specifiek voor een bepaalde DNA locus plaats waardoor amplificatie van sequenties in het monster, met inbegrip van onbekende sequenties.Het fundamentele verschil tussen de PCR en WGA maakt de werkwijzen complementair aan elkaar en geeft aanleiding tot verschillende problemen bij de toepassing.
De hoge opbrengst van WGA reacties 6 maakt routine amplificatie van genoom DNA van enkele moleculen 7, enkele cellen 8 en andere low-biomassa monsters 9 voor kwantificering of verdere analyse. De belangrijkste uitdagingen in verband met WGA chemie zijn de extreme gevoeligheid voor contaminanten en de ongelijke amplificatie over individuele template moleculen 6. Echter, WGA wint aan populariteit als single-cell sequencing heeft ontpopt als de "killer application" van WGA-technologie 10, en kwantificatie van WGA is belangrijk in vele toepassingsgebieden 7.
Instrumentatie voor digitale nucleïnezuur kwantificatie is eerder beschreven in een verscheidenheid van met klep en ventielloze microfluidic formats 11-14, waaronder druppel gebaseerde testen 15,16 (tabel 2). Echter, commerciële microfluïdische systemen voor de digitale analyse vereisen gespecialiseerde apparatuur voor de reactie en setup product detectie 17. Aangepaste klep microfluidics zijn flexibel, maar vereisen precisie microfabricage en pneumatische besturingssystemen 18. Hoewel het relatief eenvoudig om monodisperse microdruppels voor-emulsie gebaseerde digitale assays 19,20 maken digitale uitlezing is technisch omslachtig, vereist hetzij grote wide-field imaging (vergelijkbaar met populaire sequeneren volgende generatie) of 21,22 high-speed stroom-gebaseerde druppel detectie 23-25. Idealiter zou een digitale test eenvoudig van opzet zijn uitlezen, waardoor de behoefte aan ingewikkelde instrumenten en waardoor grote aantallen monsters snel worden uitgelezen. Hier beschrijven we een vereenvoudigde werkwijze voor het uitlezen van digitale druppel assays die gebruik maakt van een conventionele real-time PCR instrument om bulk van fluorescentie-druppel gebaseerde digitale testen meten.
Terwijl de nieuwe benadering kan worden toegepast op digitale PCR assays, is het bijzonder voordelig voor digitale WGA assays die analoog real time amplificatie assays (die uitstekende resultaten geven PCR) problematisch. WGA wordt algemeen toegepast op monsters met template moleculen die heterogeen sequentie, lengte en basegehalte zijn. Deze verschillende template moleculen geamplificeerd met verschillende snelheden 6, in het gebruik van een referentie ("standaard") monster met bijpassende eigenschappen. Vaak is een dergelijke standaard beschikbaar is, of de kenmerken van de inkomende monsters onbekend. De heterogeniteit van het uitgangsmateriaal en de lengte-afhankelijke eigendom van WGA chemische 26 ook bemoeilijken de interpretatie van de resultaten door het creëren van onduidelijkheid in wat er wordt gekwantificeerd – de ingang massa ingang aantal moleculen, een combinatie van de twee, of geen van beide. Fot slot, de sequentie niet-specificiteit maakt kwantitatieve meervoudige verplaatsing amplificatie (MDA) gevoeliger voor verontreiniging dan kwantitatieve PCR aangezien verontreinigende moleculen van elke sequentie hebben kunnen aantasten. Microfluïdische digitale assays pakken besmetting door scheiding template moleculen reductiereactie volumes zodanig dat minder verontreinigingen worden bemonsterd.
Hier gebruiken we een populaire isothermische WGA methode, MDA 27. Van de nota, een aantal andere WGA chemie waaronder PicoPlex en Malbac 28 afhankelijk cruciaal bij de eerste isothermale strengverplaatsing stappen. Isotherme stappen verergeren de uitdaging van de toepassing van analoge real-time assays voor kwantitatieve WGA. WGA kan niet volledig worden voorkomen tijdens de installatie, waardoor ongewenste variabele pre-amplificatie of gediscretiseerd ("cycling") op een wijze waarbij replicatie van heterogene moleculen kunnen worden gereden tot voltooiing en gestopt voorafgaand aan de volgende cyclus zoals PCR 11 </sup> (Figuur 1). Een digitale analyse-opzet voor WGA ontvangt kenmerkende reactie installatieprocedures gevolg van de scheiding van elk molecuul voor de telling van het eindpunt assay (dus voorversterking laat de resultaten) oorspronkelijke uitleesmiddelen nauwkeurigheid zou grotendeels onafhankelijk van variaties in amplificatie efficiëntie.
De assay is afhankelijk van druppeltjes geproduceerde olie met uniforme volumes, als het signaalniveau per druppel aan het eindpunt assay is afhankelijk van het volume druppel, en we niet willen dat de consistentie van resultaten afhankelijk gemiddeld over een verdeling van druppelgrootten. Maken monodisperse druppels is nu een standaard procedure (ongeveer 3.500 monodisperse druppel kranten zijn gepubliceerd sinds 2013), maar vereist microfluïdische instrumentatie 25. In feite zijn er meer dan zes bedrijven onafhankelijke commerciële producten die afhankelijk zijn van de productie van dergelijke druppels ontwikkeld, en druppel maken van microfluïdische chipscommercieel beschikbaar 23,29. Voor deze studie, gebruikten we op maat microfluïdische apparaten geproduceerd in eigen huis (zie Protocol). Spuitpompen rijden stroming door de inrichtingen zijn ook commercieel verkrijgbaar, maar als alternatief kan worden gesubstitueerd met één wegwerpspuit voor vacuüm aangedreven stroming de kosten 30 verlagen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Digitale assays zijn krachtige werkwijzen die detectie van zeldzame cellen en tellen van afzonderlijke nucleïnezuurmoleculen mogelijk. Echter, digitale assays nog niet routinematig toegepast analytische laboratoria, mede door de kosten van gespecialiseerde apparatuur verbonden met commercieel beschikbare methoden. Hier beschrijven we een eindpunt digitale assay voor het kwantificeren van nucleïnezuren met een vereenvoudigde analoge uitlezing met een standaard real-time kwantitatieve PCR machine. Deze methode is snel o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge Liyi Xu for providing MDA reagents and protocols. We also thank David Feldman and Navpreet Ranu for discussions relating to this work. This work was supported in part by a Burroughs Wellcome Career Award at the Scientific Interface to PCB.
Materials
| Evagreen Dye | Biotium | 31000 | |
| Bovine serum albumin | New England Biotechnologies | B9000S | |
| Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer | New England Biotechnologies | B0269S | Vortex periodically until aggregate dissolves |
| Lambda DNA | New England Biotechnologies | N3011S | Heated to 50C and quenched on ice prior to dilution |
| Randomized MDA oligos | Integrated DNA Technologies | 5'-NNNNN*N-3' | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | 5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’ | |
| UltraPure Nuclease-free water | Life Technologies | 10977-015 | UV-treated for 30m in Stratalinker 2400 before use (optional) |
| ROX reference dye | Life Technologies | 12223-012 | |
| PCR optical strip caps | Life Technologies | 4323032 | |
| PCR tubes | Agilent Technologies | 401428 | |
| dNTP (25uM each) | Agilent Technologies | 200415 | |
| Thermocycler – Mx3000P qPCR system | Agilent Technologies | 401403 | |
| Barrier pipette tips | VWR | 89003-046 | |
| Bio-rad oil for evagreen | Bio-rad | 186-4005 | |
| JumpStart Taq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P2893-100RXN |
References
- Sykes, P. J., Neoh, S. H., Brisco, M. J., Hughes, E., Condon, J., Morley, A. A. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).
- Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. Nanoliter scale PCR with TaqMan detection. Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Day, E., Dear, P. H., McCaughan, F. Digital PCR strategies in the development and analysis of molecular biomarkers for personalized medicine. Methods. 59 (1), 101-107 (2013).
- Tatusova, T., Ciufo, S., Fedorov, B., O’Neill, K., Tolstoy, I. RefSeq microbial genomes database: new representation and annotation strategy. Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D553-D559 (2014).
- Blainey, P. C. The future is now: single-cell genomics of bacteria and archaea. FEMS Microbiol. Rev. 37 (3), 407-427 (2013).
- Blainey, P. C., Quake, S. R. Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination. Nucleic Acids Res. 39 (4), e19 (2011).
- Blainey, P. C., Quake, S. R. Dissecting genomic diversity, one cell at a time. Nat. Methods. 11 (1), 19-21 (2014).
- Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology. ISME J. 2 (3), 233-241 (2008).
- . Method of the Year 2013. Nature Methods. 11 (1), 1 (2014).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria. Science. 314 (5804), 1464-1467 (2006).
- Shen, F., Du, W., Kreutz, J. E., Fok, A., Ismagilov, R. F. Digital PCR on a SlipChip.. Lab Chip. 10 (20), 2666-2672 (2010).
- Heyries, K. A., et al. Megapixel digital PCR. Nat. Methods. 8 (8), 649-651 (2011).
- Dressman, D., Yan, H., Traverso, G., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (15), 8817-8822 (2003).
- Kiss, M. M., et al. High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets. Anal. Chem. 80 (23), 8975-8981 (2008).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nat. Methods. 9 (6), 3 (2012).
- Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Parallel picoliter rt-PCR assays using microfluidics. Anal. Chem. 78 (3), 956-958 (2006).
- Lee, M., et al. Synchronized reinjection and coalescence of droplets in microfluidics. Lab Chip. 14 (3), 509-513 (2014).
- Rhee, M., et al. Pressure stabilizer for reproducible picoinjection in droplet microfluidic systems. Lab Chip. 14 (23), 4533-4539 (2014).
- Hatch, A. C., et al. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab Chip. 11 (22), 3838-3845 (2011).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
- Lage, J. M., et al. Whole genome analysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH. Genome Res. 13 (2), 294-307 (2003).
- Dean, F. B., et al. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (8), 5261-5266 (2002).
- Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell. Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).
- Abate, A. R., Weitz, D. A. Syringe-vacuum microfluidics: A portable technique to create monodisperse emulsions. Biomicrofluidics. 5, 14107 (2011).
- Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells. J Vis Exp. (80), e50618 (2013).
- Fainman, Y. . Optofluidics : fundamentals, devices, and applications. , (2010).
- Xia, Y. W. G.M. Softlithographie. Angew Chem. 110 (5), 26 (1998).
- Woyke, T., et al. Decontamination of MDA reagents for single cell whole genome amplification. PLoS One. 6 (10), e26161 (2011).
- Hindson, B. J. System for hot-start amplification via a multiple emulsion. US patent. , (2014).
- Utada, A. S., et al. Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device. Science. 308 (5721), 537-541 (2005).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR. PLoS One. 8 (4), e62961 (2013).
- Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device. PLoS One. 3 (8), e2876 (2008).
- Shen, F., et al. Multiplexed quantification of nucleic acids with large dynamic range using multivolume digital RT-PCR on a rotational SlipChip tested with HIV and hepatitis C viral load. J Am. Chem. Soc. 133 (44), 17705-17712 (2011).
- Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices. Phys. Rev. Lett. 92 (5), 054503 (2004).
- Nisisako, T., Torii, T. Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles. Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).
- Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device. Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).
