数字核酸定量实验分析的简单堆积读数
Summary
We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.
Abstract
数字测定是强大的方法，使检测稀有细胞和单个核酸分子的计数。但是，数字实验仍然没有常规应用，由于成本，并与商购的方法相关联的特定设备。在这里，我们提出了一个简单的方法，使用传统的实时PCR仪测量液滴为基础的数字检测散装荧光数字墨滴检测读数。
我们表征使用合成的液滴的混合物和液滴数字多重置换扩增（MDA）的测定中的散装读数测定法的性能。定量MDA特别是从数字的反应形式的好处，但我们的新方法适用于任何数字检测。为建立数字测定协议，如数字PCR，该方法用于加快和简化测定读数。
我们的批量读取方法带来partitione的优势ð测定，而不需要专门的读取仪表。墨滴计数平台以及需要的标准样品相比，大部分的读出方法的主要限制是减少的动态范围，虽然对于这个标准的要求比以往的实时实验要求不高。定量全基因组扩增（WGA）被用来测试在WGA反应污染物是最敏感的方法来检测具有未知序列的DNA片段的存在，从而在不同的应用领域，包括药物质量控制和天体生物学方法巨大潜力。
Introduction
数字测定核酸定量（数字PCR），1-4和基本顺序（顺序）的强烈影响生命科学和医学。数字分析提供分子计数定量在绝对规模（而不是相对于对照），提供高灵敏度，在整个实验中实现浅显的比较，重要的是，使含可比数据5（表1）大型数据库的建设。
在过去的15年中，全基因组扩增（WGA）出现旁边的PCR作为用于核酸扩增的通用工具。像的PCR，WGA为通过放大分钟样品的元素最多可以很容易地检测或用于随后的分析像碱基测序的水平分析和制备应用中有用。不像PCR，WGA不是特定于特定的DNA位点，而允许在样品中的所有序列，包括未知序列的扩增。PCR和WGA之间的这种根本差异使得互补彼此的方法和引起在他们的应用程序不同的挑战。
高产的WGA反应6的使基因组DNA的单分子7，单个细胞8和其它低生物质的样品9，用于量化或进一步分析例程扩增。与WGA化学相关的主要挑战是它的极端敏感性污染物和整个个体模板分子6不均匀放大。但是，WGA逐渐流行为单细胞测序已成为“杀手级应用”WGA技术10，和模板的定量通过WGA是在应用程序7中许多领域的重要。
仪器的数字核酸量化已在各种阀联结且无气门的微流体形式上的先前已经描述TS 11-14包括液滴基试验15,16（ 表2）。然而，商用的微流体系统用于数字分析需要专门的设备以进行反应的设置和产物检测17。自阀微流体是灵活的，但需要精密微细加工和气动控制系统18。虽然这是相对简单的，使单分散的微滴乳化为基础的数字测定19,20，数字读出在技术上是麻烦的，需要无论大型宽视场成像（类似于流行下一代测序技术）21,22或高速的基于流滴检测23-25。理想情况下，数字检测将是从设置简单到读出，减少了需要复杂的仪器，并允许大量样品被迅速地读出。在这里，我们描述了用于数字液滴测定读出一个简化的方法，该方法使用常规的实时PCR我nstrument测量液滴为基础的数字检测散装荧光。
虽然新的方法可以应用到数字PCR测定法，它是用于该模拟的实时扩增分析（即提供优良的效果进行PCR）是有问题的数字的WGA实验特别有利的。 WGA通常应用于样本与模板分子的异质在序列，长度和基本内容。这些不同的模板分子扩增以不同速率6，迫使使用基准（“标准”）具有匹配特性的样品。通常情况下，没有这样的标准是可用的，或传入样本的特性是未知的。输入质量，分子的输入数，两个，或既不的组合- WGA化学的输入材料和长度依赖性属性的异质26还通过创建歧义什么被定量复杂化的结果的解释。 Finally，序列 – 非特异性呈现定量多重置换扩增（MDA）的更多的污染比定量PCR敏感，因为任何序列的污染物分子有一个潜在的干扰。微流体数字分析解决污染通过分离模板分子和减少的反应体积，使得更少的污染物被采样。
在这里，我们使用了流行的等温WGA的方法，MDA 27。值得注意的是，其他几个WGA化学品，包括PicoPlex和MALBAC 28关键取决于最初的等温链置换步骤。等温步骤加剧施加模拟实时测定法进行定量的WGA的挑战。 WGA既不能在安装过程中被完全防止，从而导致不希望的可变预放大，也不离散（“循环”）的方式，其中异构分子的复制可以被驱动到完成并停止之前，下一个周期的PCR像11 </suP>（ 图1）。对于WGA数字测定形式可容纳典型的反应中的设置过程，由于每个分子为枚举在测定端点的偏析（因此扩增前不影响结果）原始读出装置的精度将是基本上独立变化的扩增效率。
该试验依赖于产生油具有均匀体积的液滴，作为每滴的信号电平在测定端点将取决于液滴体积上，我们不希望结果的一致性取决于跨越液滴尺寸的分布平均化。制造单分散的液滴是现在的标准程序（约3500的单分散液滴论文已自2013出版），但要求的微流体的仪器25。事实上，六年多的公司已经开发出依赖于生产这样的液滴独立的商业产品，和液滴制作微流控芯片市售23,29。在这项研究中，我们使用了内部（见协议）生产的定制微流体装置。注射泵来驱动流过器件也可商购的，但可替换地，可以用一个一次性注射器的真空驱动的流动被取代，以降低成本30。
Protocol
Representative Results
Discussion
数字测定是强大的方法，使检测稀有细胞的计数和个体的核酸分子组成。但是，数字实验仍然不是常规分析实验室应用，部分原因是由于与市售的方法相关联的专门设备的成本。在这里，我们描述端点数字测定用于定量核酸与使用标准的实时定量PCR机器的简化模拟读出。这种方法是快速建立，和读出比液滴计数方法简单得多。
我们的分析将丧失独立液滴测量的单分子（单滴?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge Liyi Xu for providing MDA reagents and protocols. We also thank David Feldman and Navpreet Ranu for discussions relating to this work. This work was supported in part by a Burroughs Wellcome Career Award at the Scientific Interface to PCB.
Materials
| Evagreen Dye | Biotium | 31000 | |
| Bovine serum albumin | New England Biotechnologies | B9000S | |
| Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer | New England Biotechnologies | B0269S | Vortex periodically until aggregate dissolves |
| Lambda DNA | New England Biotechnologies | N3011S | Heated to 50C and quenched on ice prior to dilution |
| Randomized MDA oligos | Integrated DNA Technologies | 5'-NNNNN*N-3' | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | 5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’ | |
| UltraPure Nuclease-free water | Life Technologies | 10977-015 | UV-treated for 30m in Stratalinker 2400 before use (optional) |
| ROX reference dye | Life Technologies | 12223-012 | |
| PCR optical strip caps | Life Technologies | 4323032 | |
| PCR tubes | Agilent Technologies | 401428 | |
| dNTP (25uM each) | Agilent Technologies | 200415 | |
| Thermocycler – Mx3000P qPCR system | Agilent Technologies | 401403 | |
| Barrier pipette tips | VWR | 89003-046 | |
| Bio-rad oil for evagreen | Bio-rad | 186-4005 | |
| JumpStart Taq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P2893-100RXN |
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