Lecture simple de vrac numériques acide nucléique quantification dosages

Summary

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Abstract

Essais numériques sont puissantes méthodes qui permettent la détection de cellules rares et de comptage individuels des molécules d'acide nucléique. Cependant, des essais numériques sont toujours pas systématiquement appliqué, en raison du coût et des équipements spécifiques associés aux méthodes disponibles dans le commerce. Nous présentons ici une méthode simplifiée pour la lecture des tests de gouttelettes numériques en utilisant un instrument conventionnel-PCR en temps réel pour mesurer la fluorescence en vrac de tests numériques de gouttelettes d'émulsion.

Nous caractérisons les performances de l'essai de lecture en vrac en utilisant des mélanges de gouttelettes de synthèse et une analyse numérique des gouttelettes amplification par déplacement multiple (MDA). Quantitative MDA particulier bénéficie d'un format numérique, mais la réaction de notre nouvelle méthode applique à toute analyse numérique. Pour les protocoles d'essai numériques établies telles que la PCR numérique, cette méthode sert à accélérer et simplifier dosage lecture.

Notre méthodologie vrac de lecture apporte les avantages de partitioneessais D, sans la nécessité d'une instrumentation spécialisée lecture. Les principales limites de la méthodologie de lecture encombrement sont réduits gamme dynamique par rapport aux plates-formes de gouttelettes de comptage et la nécessité d'un échantillon standard, bien que les exigences de cette norme sont moins exigeants que pour une expérience en temps réel classique. Quantitative toute amplification du génome (WGA) est utilisé pour tester les contaminants dans les réactions WGA et est le moyen le plus sensible pour détecter la présence de fragments d'ADN avec des séquences inconnues, donnant la méthode très prometteuse dans divers domaines d'application, y compris le contrôle de la qualité pharmaceutique et l'astrobiologie.

Introduction

Essais numériques pour la quantification de l'acide nucléique (PCR numérique) ^1-4 et la base afin (séquençage) sont fortement un impact sur ​​les sciences de la vie et de la médecine. Dosages numériques offrent quantification des chiffres moléculaires sur une échelle absolue (pas par rapport à un contrôle), offrant une haute sensibilité, permettant des comparaisons faciles à travers des expériences, et, surtout, permettant la construction de grandes bases de données contenant des données comparables ⁵ (Tableau 1).

Au cours des 15 dernières années, toute amplification du génome (WGA) est apparu aux côtés de PCR comme un outil général pour l'amplification de l'acide nucléique. Comme PCR, WGA est utile pour les applications d'analyse et de préparation en amplifiant éléments de l'échantillon minute jusqu'à un niveau qui peut être facilement détecté ou utilisé pour des analyses ultérieures comme le séquençage de base. Contrairement à la PCR, WGA sont pas spécifiques à un locus d'ADN particulière, ce qui permet plutôt amplification de toutes les séquences de l'échantillon, y compris des séquences inconnues.Cette différence fondamentale entre PCR et WGA rend les méthodes complémentaires les uns aux autres et donnent lieu à des problèmes différents dans leur application.

Le rendement élevé de réactions WGA ⁶ permet l'amplification de routine de l'ADN génomique à partir de molécules simples ^{7, 8} cellules individuelles et d'autres échantillons à faible biomasse ⁹ pour la quantification ou une analyse plus approfondie. Les principaux défis associés à la chimie WGA sont son extrême sensibilité aux contaminants et l'amplification inégale entre les molécules de matrice individuelles ^6. Popularité Cependant, WGA gagne que le séquençage cellule unique a émergé comme le "killer application" de la technologie de WGA ^10, et le modèle quantification par WGA est important dans de nombreux domaines d'application ^7.

Instrumentation pour la quantification d'acide nucléique numérique a été précédemment décrit dans une variété de valved et sans valve microfluidique forma^11-14 ts, y compris les essais à base de gouttelettes ^15,16 (tableau 2). Cependant, les systèmes microfluidiques commerciales pour l'analyse numérique nécessitent de l'équipement spécialisé pour la configuration de réaction et la détection de produits ^17. Microfluidique valved personnalisée sont flexibles, mais nécessitent microfabrication de précision et des systèmes de contrôle pneumatiques ^18. Alors qu'il est relativement simple de faire des micro-gouttelettes monodispersées pour des essais numériques à base d'émulsion ^19,20, affichage numérique est techniquement lourde, nécessitant soit l'imagerie à grand champ à grande échelle (similaire aux technologies populaires de séquençage de prochaine génération) ou ^21,22 haute vitesse d'écoulement à base de détection de gouttelette ^23-25. Idéalement, une analyse numérique serait simple de mettre en place à la lecture, réduisant la nécessité d'une instrumentation complexe et permettant un grand nombre d'échantillons à lire rapidement. Nous décrivons ici une méthode simplifiée pour la lecture des tests de gouttelettes numériques qui utilise en temps réel classique PCR iNSTRUMENT pour mesurer la fluorescence en vrac de tests numériques de gouttelettes d'émulsion.

Alors que la nouvelle approche peut être appliquée à des tests de PCR numériques, il est particulièrement avantageux pour les dosages WGA numériques analogiques pour lesquels les tests d'amplification en temps réel (qui donnent d'excellents résultats pour la PCR) sont problématiques. WGA est généralement appliquée à des échantillons de molécules de matrice qui sont hétérogènes en séquence, la longueur et le contenu de la base. Ces différentes molécules de matrice sont amplifiés à des taux différents ^6, ce qui nécessite l'utilisation d'une référence ("standard") avec des caractéristiques correspondant à l'échantillon. Souvent, de telles normes est disponible, ou les caractéristiques des échantillons entrants sont inconnus. L'hétérogénéité de la matière d'entrée et des biens dépendant de la longueur des chimies WGA ²⁶ compliquent également l'interprétation des résultats par la création d'ambiguïté dans ce qui est quantifié – la masse d'entrée, le numéro d'entrée de molécules, une combinaison des deux, ou aucun des deux. Fnfin, la séquence de non-spécificité rend quantitative amplification par déplacement multiple (MDA) plus sensibles à la contamination que la PCR quantitative puisque les molécules contaminantes de toute séquence ont un potentiel d'interférer. Dosages numériques microfluidiques lutter contre la contamination en séparant les molécules de modèle et de la réduction des volumes de réaction de telle sorte que moins de contaminants sont échantillonnés.

Ici, nous utilisons une méthode WGA isotherme populaire, MDA ^27. Fait à noter, plusieurs autres chimies WGA y compris PicoPlex et malbac ²⁸ dépendent de façon cruciale sur les mesures initiales de déplacement isotherme de brins. Étapes isothermes exacerbent le défi de l'application de tests analogiques en temps réel pour WGA quantitative. WGA ne peut ni être entièrement évitée pendant l'installation, conduisant à indésirables pré-amplification variable, ni discrétisation ("cycling") dans une voie où la réplication de molécules hétérogènes peut être conduit à son terme et a cessé avant le prochain cycle comme PCR ¹¹ </sup> (Figure 1). Un format numérique de dosage pour WGA accueille procédures typiques de configuration de réaction due à la ségrégation de chaque molécule pour le dénombrement au point final de dosage (sorte de pré-amplification n'a pas d'incidence sur les résultats) lecture originale signifie précision serait largement indépendante de la variation de l'efficacité d'amplification.

Le dosage dépend de gouttelettes produites dans l'huile avec des volumes uniformes, que le niveau du signal par gouttelette à l'extrémité de dosage dépendra du volume de gouttelettes, et nous ne voulons pas la cohérence des résultats de dépendre d'une moyenne à travers une distribution de tailles de gouttelettes. Faire gouttelettes monodispersées est maintenant une procédure standard (environ 3.500 documents de gouttelettes monodispersées ont été publiés depuis 2013), mais nécessite une instrumentation microfluidique ^25. En fait, plus de six sociétés ont développé des produits commerciaux indépendants qui comptent sur la production de ces gouttelettes, et puces microfluidiques gouttelettes de décision sont^23,29 disponible dans le commerce. Pour cette étude, nous avons utilisé des dispositifs microfluidiques personnalisé produites en interne (voir Protocole). Pompes seringue pour conduire l'écoulement à travers les dispositifs sont également disponibles dans le commerce, mais encore, peut être remplacé par une seule seringue jetable pour l'écoulement entraîné sous vide pour réduire les coûts ^30.

Protocol

Remarque: Fabrication du dispositif microfluidique est pas nécessaire pour cet essai, sous forme de gouttelettes de ce protocole peuvent être formés avec des décideurs de gouttelettes commerciales existantes 23,29. 1. Faire le dispositif microfluidique gouttelettes formant Préparer moule maître pour les canaux avec le protocole SU-8 Fabrication de Maître indiqué précédemment 31, mais avec un masque motif générateur de gouttelettes 32.<…

Representative Results

Alors que les lectures en vrac classique / en temps réel peuvent être utilisés à la fois pour la PCR quantitative et analyses quantitatives de WGA (Figure 1), des essais quantitatifs numériques offrent des avantages (tableau 1). Dans le procédé décrit, nous lisons des dosages numériques au format micro-gouttelettes avec une mesure de point final en vrac simple (Figure 2). Bien que cette méthode est largement applicable, nous nous concentrons sur WGA quantitati…

Discussion

Essais numériques sont puissantes méthodes qui permettent la détection de cellules rares et de comptage individuels des molécules d'acide nucléique. Cependant, les essais numériques sont toujours pas appliquées systématiquement dans les laboratoires d'analyse, en partie à cause du coût de l'équipement spécialisé associée à des méthodes disponibles dans le commerce. Nous décrivons ici une analyse numérique pour quantifier extrémité des acides nucléiques avec un affichage analogique simpli…

Materials

Evagreen Dye	Biotium	31000
Bovine serum albumin	New England Biotechnologies	B9000S
Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer	New England Biotechnologies	B0269S	Vortex periodically until aggregate dissolves
Lambda DNA	New England Biotechnologies	N3011S	Heated to 50C and quenched on ice prior to dilution
Randomized MDA oligos	Integrated DNA Technologies		5'-NNNNN*N-3'
PCR primers	Integrated DNA Technologies		5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’
UltraPure Nuclease-free water	Life Technologies	10977-015	UV-treated for 30m in Stratalinker 2400 before use (optional)
ROX reference dye	Life Technologies	12223-012
PCR optical strip caps	Life Technologies	4323032
PCR tubes	Agilent Technologies	401428
dNTP (25uM each)	Agilent Technologies	200415
Thermocycler – Mx3000P qPCR system	Agilent Technologies	401403
Barrier pipette tips	VWR	89003-046
Bio-rad oil for evagreen	Bio-rad	186-4005
JumpStart Taq ReadyMix	Sigma-Aldrich	P2893-100RXN