Voorbereiding van Mica en Silicon substraten voor DNA Origami Analyse en Experimentation
Summary
Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.
Abstract
The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.
Introduction
Voor het eerst geïntroduceerd in 2006, DNA-origami maakt gebruik van de zelfassemblerende aard van DNA-oligonucleotiden om ontwerpbaar en sterk geordende nanostructuren te produceren. 1 Een groot aantal structuren zijn gemeld, variërend van smiley gezichten tot 3-dimensionale dozen vergrendeld. 2 DNA-origami kunnen worden gefunctionaliseerd met verschillende biomoleculen en nanostructuren, die tot onderzoekstoepassingen in nano-elektronica, medicijnen en quantum computing. 3 De analyse en vele toekomstige toepassingen zijn niet alleen afhankelijk van constructie, maar ook de hechting van het DNA origami nanostructuren op oppervlakken. De in dit manuscript beschreven methoden hebben betrekking op de voorbereiding van de DNA-origami samples op twee soorten ondergronden: mica en gefunctionaliseerd siliciumoxide.
Mica is het substraat bij uitstek voor DNA origami studies omdat het atomair vlak, met een laag hoogte van 0,37 ± 0,02 nm nm. 4 is ook easily gereinigd, waardoor monstervoorbereiding en atomic force microscopie (AFM) studies eenvoudig. Micamica bevat een hoge dichtheid kalium per splijtenvliegtuig, maar deze ionen diffunderen van het mica oppervlak indien in water. Om de binding van DNA origami mediëren de mica substraat, Mg2 + wordt gebruikt om de negatieve lading van het mica keren en elektrostatisch DNA fosfaatruggengraat op het substraat (Figuur 1A) binden. 5 Mengsels van gehybridiseerd DNA in de aanwezigheid van grote uitwassen van stapelvezels strengen te hoge dekkingsgraad en goede afbeeldingen op mica omdat de hechting van DNA origami de Mg2 + -terminated oppervlak veel sterker dan de hechting van enkelstrengs oligonucleotiden (stapelvezels draden). Andere positief geladen ionen, zoals Ni2 + en Co2 + kan worden gebruikt om de hechting van DNA op mica controleren. 6,7 veranderen van de concentratie van eenwaardige en tweewaardige kationen in oplossing adhe mediërenSion en verspreiding oppervlak tarieven van DNA origami. 8 Echter, het protocol voor het bereiden van mica substraten en het storten en het spoelen van de origami wordt vaak niet expliciet beschreven in gepubliceerde manuscripten. 9 Zonder een duidelijk protocol, kunnen reproduceerbare resultaten moeilijk te verkrijgen zijn.
Mica is een isolator, dus het is niet geschikt als een substraat voor sommige toepassingen in de nano-elektronica. Silicon gepassiveerd met een dunne inheemse oxide heeft gewenste elektronische eigenschappen, met inbegrip van de compatibiliteit met eerdere gratis Metal-Oxide Semiconductor (CMOS) verwerking input / output structuren en topografische kenmerken creëren. Silicium wafers opgeslagen in de lucht worden gepassiveerd met ofwel een dikke thermisch oxide of dunne inheemse oxide film die relatief vies, met een hoge deeltjes tellen. Silicium oxide heeft een veel lagere oppervlakladingsdichtheid dan mica en de ladingsdichtheid is sterk afhankelijk oxide voorbereiding en geschiedenis. Bij magnesium ion concentratie above 150 mM, goede dekkingen (tot 4 / um 2) van rechthoekige DNA origami kan worden bereikt op zuurstofplasma behandeld silicium substraten; echter kan deze concentratie en dekking veranderen afhankelijk van de grootte en het ontwerp van de nanostructuren worden gebruikt. 10 Een alternatief protocol voor het afstemmen van de oppervlaktelading is een kationisch zelf samengestelde monolaag van 3-aminopropyltriethoxysilaan (APTES) (Figuur 1B) hechten aan het oxyde. Het primaire amine op APTES kan worden geprotoneerd bij pH-waarden lager dan 9, modificeren van de lading en hydrofobiciteit van het substraat. 11 Voor een volledige monolaag van APTES met succes worden gedeponeerd, dient het silicium geschikt worden gereinigd met Radio Corporation of America (RCA) protocols . Deze protocollen zijn onder andere behandelingen in ammoniumhydroxide en waterstofperoxide oplossingen (RCA1) om organische resten en deeltjes verontreinigingen te verwijderen. Beknopte etch in waterig fluorwaterstofzuur verwijdert de natuurlijke oxidelaag metionische contaminanten die zich aan het oxide. Tenslotte worden de monsters blootgesteld aan een chloorwaterstofzuur en waterstofperoxideoplossing (rca2) metalen en ionische verontreinigingen te verwijderen en een dunne, uniforme oxidelaag. 12 meeste cleanrooms zijn kappen aangewezen CMOS reinigingsprotocollen, strikte regels wat kan worden gebruikt in deze gebieden. Een veel voorkomend probleem komt in de vorm van ionen zoals natrium, die de elektronische eigenschappen van CMOS structuren kunnen verstoren door het creëren midbandgap vallen. 13 ionen algemeen in DNA origami voorbereiding en depositie buffers CMOS baden kunnen vervuilen en leiden tot problemen voor andere onderzoekers die de clean room. Daarom onze groep een "vuile" CMOS reinigen bench specifiek ingericht voor de kleine monsters gebruikt voor DNA origami onderzoek. Dit proces is een goed alternatief voor de traditionele cleanroom set-up en kan geschikt zijn voor laboratoria die geen toegang hebben tot een cleanroom CMOS bank hoeft te hebben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn verschillende stappen die moeten worden benadrukt om consistente en ideaal resultaten te bereiken. Voor mica monsters, na een streng en grondig spoelen en drogen van het regime, zoals in de stappen 3.3 en 3.4, zal ervoor zorgen dat de beelden van hoge kwaliteit van de afzonderlijke DNA-origami kan worden bereikt met behulp van AFM zonder de verschillende problemen die in de Representatieve resultaten sectie. Van primair belang voor silicium monsters is de netheid van de ondergrond. Volgens de reinigingsprocedure…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Gary Bernstein for use of the AFM.
Materials
| Eppendorf epT.I.P.S. Reloads, capacity 2-200 μL | VWR International, LLC | 22491733 | 10 reload tray of 96 tips |
| Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR International, LLC | 87003-290 | 0.65 mL, natural |
| Research Plus Pippete – Single Channel – 20-200 μL | A. Daigger & Company, Inc. | EF8960F-3120000054 EACH | Adjustable Volume |
| Research Plus Pippete – Single Channel – 2-20 μL | A. Daigger & Company, Inc. | EF8960D-3120000038 EACH | Adjustable Volume |
| Scotch 237 Permanent Double-Sided Tape | Office Depot, Inc. | 602710 | 3/4" x 300", Pack of 2 |
| Vortex Mixer | Thermo Scientific | M37610-33Q | |
| Wafer container single, 2" (50 mm), 60 mm x 11 mm | Electron Microscopy Sciences | 64917-2 | 6 per pack |
| 6" Wafer, P-type, <100> orientation, w/ primary flat | Nova Electronic Materials, Ltd. | GC49266 | |
| Powder-Free Nitrile Examination Gloves | VWR International, LLC | 82062-428 | Catalog number is for size large |
| High Accuracy Noncontact probes with Au reflective coating | K-Tek Nanotechnology, Inc. | HA_NC/15 | |
| Autoclave Pan | A. Daigger & Company, Inc. | NAL692-5000 EF25341C | |
| Sol-Vex II Aggressive Gloves, Size: 9-9.5; 15 mil, 13 inch – 1 dz | Spectrum Chemical Mfg. Corp. | 106-15055 | Before use, rinse with water and scrub together until no bubbles form on the gloves. |
| Tweezers PTFE 200 mm Square | Dynalon Corp. | 316504-0002 | |
| Muscovite Mica Sheets V-5 Quality | Electron Microscopy Sciences | 71850-01 | 10 per pack |
| Mica Disc, 10 mm | Ted Pella, Inc | 50 | Mica discs are optional |
| Scriber Diamon Pen for Glassware | VWR International, LLC | 52865-005 | |
| Scintillation Vials, Borosilicate Glass, with Screw Cap – 20 mL | VWR International, LLC | 66022-060 | Case of 500, with attached polypropylene cap and pulp foil liner |
| 4 x 5 Inch Top PC-200 Hot Plate, 120 V/60 Hz | Dot Scientific, Inc. | 6759-200 | |
| Straight-Sided Glass Jars, Wide Mouth | VWR International, LLC | 89043-554 | Case of 254, caps with pulp/vinyl liner attached |
| Standar-Grade Glass Beaker, 250 mL Capacity | VWR International, LLC | 173506 | |
| Beakers, PTFE | VWR International, LLC | 89026-022 | For use with HF |
| Shallow form watch glass, 3" | VWR International, LLC | 66112-107 | Case of 12 |
| Plastic Storage Container | VWR International, LLC | 470195-354 | For secondary container |
| General-Purpose Liquid-In-Glass Thermometers | VWR International, LLC | 89095-564 | |
| High precision and ultra fine tweezers | Electron Microscopy Sciences | 78310-0 | |
| Polycarbonate Faceshield | Fisher Scientific, Inc. | 18-999-4542 | |
| Neoprene Apron | Fisher Scientific, Inc. | 19-810-609 | |
| Calcium Gluconate, Calgonate | W.W Grainger, Inc. | 13W861 | Tube, 25 g |
| Hydrogen Peroxide 30 % CR ACS 500 mL | Fisher Scientific, Inc. | H325 500 | HARMFUL, TOXIC |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | Gelest Inc. | SIA0610.0-25GM | Let warm to room temperature before use. |
| Ammonium hydroxide, 2.5 L | Fisher Scientific, Inc. | A669-212 | HARMFUL, TOXIC |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific, Inc. | A144-212 | HARMFUL, TOXIC |
| Hydrofluoric acid | Fisher Scientific, Inc. | A147-1LB | HARMFUL, TOXIC |
| MultiMode Nanoscope IIIa | Veeco Instruments, Inc. | n/a | Any AFM capable of tapping mode is suitable for analysis |
| Dunk basket | Made in lab | Made in lab | The dunk basket was made using the bottom of a PTFE bottle with holes drilled in, PTFE handle, and all PTFE screws. |
References
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, 297-302 (2006).
- Anderson, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459, 73-77 (2009).
- Wang, Z., Ding, B. Engineering DNA Self-Assemblies as Templates for Functional Nanostructures. Acc. Chem. Res. 47, 1654-1662 (2014).
- Xu, K., et al. Graphene Visualizes the First Water Adlayers on Mica at Ambient Conditions. Science. 329, 1188-1191 (2010).
- Bustamante, C., et al. Circular DNA-molecules imaged in air by scanning force microscopy. Biochemistry. 31, 22-26 (1992).
- Hsueh, C., et al. Localized Nanoscopic Surface Measurements of Nickel-Modified Mica for Single-Molecule DNA Sequence Sampling. ACS Appl Mater. Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).
- Pastre, D., et al. Anionic polyelectrolyte adsorption on mica mediated by multivalent cations: A solution to DNA imaging by atomic force microscopy under high ionic strengths. Langmuir. 22, 6651-6660 (2006).
- Woo, S., et al. Self-assembly of two-dimensional DNA origami lattices using cation-controlled surface diffusion. Nature Communications. 5, 4889 (2014).
- Vesenka, J., et al. Substrate preparation for reliable imaging of DNA molecules with the scanning force microscope. Ultramicroscopy. 42-44, 1243-1249 (1992).
- Albrechts, B., et al. Adsorption studies of DNA origami on silicon dioxide. , (2010).
- Sarveswaran, K., et al. Adhesion of DNA Nanostructures and DNA Origami to lithographically patterned self-assembled monolayers in Si[100]. Proc. of SPIE-Soc. Opt. Eng. 7637, 76370M-1 (2010).
- Kern, W., Puotien, D. A. Cleaning solutions based on hydrogen peroxide for use in silicon semiconductor technology. RCA Rev. 31, 187-206 (1970).
- Pillers, M., Goss, V., Lieberman, M. Electron-Beam Lithography and Molecular Liftoff for Directed Attachment of DNA Nanostructures on Silicon: Top-down Meets Bottom-up. Acc. Chem. Res. 47, 1759-1767 (2014).
- Saccá, B., Niemery, C. M. DNA Origami: The Art of Folding DNA. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 58-66 (2012).
- Douglas, S. M., et al. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Res. 37, 5001-5006 (2009).
- Ben-Ishay, E., et al. Designing a Bio-responsive Robot from DNA. Origami. J. Vis. Exp. (77), e50268 (2013).
- Woo, S., et al. Programmable molecular recognition based on the geometry of DNA nanostructures. Nature Chemistry. 3, 620-627 (2011).
- Schlegel, M. L., et al. Cation sorption on the muscovite (001) surface in chloride solutions using high-resolution X-ray reflectivity. Geochim. Cosmochim. Acta. 70, 3549-3565 (2006).
- Rasband, W. S., Howarter, J. A., et al. National Institutes of Health. Langmuir. 22, 11142-11147 (2006).
- Kershner, R. J., et al. Placement and orientation of individual DNA shapes on lithographically patterned surfaces. Nature Nanotechnology. 4, 557-561 (2009).
- Hung, A. M., et al. Large-area spatially ordered arrays of gold nanoparticles directed by lithographically confined DNA origami. Nature Nanotechnology. 5, 121-126 (2010).
- Sarveswaran, K., et al. et al.Adhesion of DNA nanostructure and DNA origami to lithographically patterned self-assembled monolayers on Si[100. Proc. SPIE-Int. Soc. Opt. Eng. 7637, 76370M (2010).
- Pillers, M. A., Lieberman, M. Thermal stability of DNA origami on mica. J. Vac. Sci. Technol. B. 32, 040602 (2014).
- Song, J., et al. Direct Visualization of Transient Thermal Response of a DNA. Origami. J. Am. Chem. Soc. 134, 9844 (2012).
- Wei, X., et al. Mapping the thermal behavior of DNA origami nanostructures. J. Am. Chem. Soc. 135 (16), 6165-6176 (2013).
- Hyojeong Kim, ., et al. Stability of DNA Origami Nanostructures under Diverse Chemical Environments. Chem. Mater. 26, 5265-5273 (2014).
