Herstellung von Mica und Siliziumsubstraten für die DNA-Origami-Analyse und Experimentieren

Summary

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

Abstract

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Introduction

Zuerst im Jahr 2006 eingeführt wurde, nutzt DNA-Origami die selbstorganisierende Natur von DNA-Oligonukleotiden auf gestaltbar und hochgeordnete Nanostrukturen zu erzeugen. ¹ Eine Vielzahl von Strukturen berichtet, von Smiley-Gesichter auf 3-dimensionale-Boxen verriegelt. ² DNA-Origami kann funktionalisiert werden mit verschiedenen Biomolekülen und Nanostrukturen, was zu Forschungsanwendungen in der Nanoelektronik, Medizin und Quantencomputing. ^3, die Analyse und viele zukünftige Anwendungen sind jedoch nicht nur abhängig von Konstruktion, sondern auch auf die Haftung der DNA-Origami-Nanostrukturen auf Oberflächen. Die in diesem Manuskript beschriebenen Verfahren betreffen die Herstellung von DNA origami Proben auf zwei Arten von Substraten: Glimmer und funktionalisierten Siliziumoxid.

Mica ist das Substrat der Wahl für die DNA-Origami-Studien, da es atomar flach, mit einer Schichthöhe von 0,37 nm 0,02 nm ±. ⁴ Es ist auch easily gereinigt, so dass die Probenvorbereitung und Rasterkraftmikroskopie (AFM) Untersuchungen unkompliziert. Muskovit-Glimmer enthält, die eine hohe Dichte von Kalium in jedem Spaltebene, aber diese Ionen diffundieren weg von der Glimmer-Oberfläche, wenn sie in Wasser. Um die Bindung von DNA an die origami Glimmersubstrat vermitteln, Mg ²⁺ in der Gegenwart von großen verwendet, um die negative Ladung des Glimmer umkehren und elektrostatisch zu binden, die DNA-Phosphat-Rückgrat mit dem Substrat (1A). ⁵ Mischungen von DNA anneliert Exzesse der Klammerstränge geben hohe Reichweite und gute Bilder von Glimmer, weil die Haftung der DNA-Origami auf die Mg ²⁺ -terminierten Oberfläche ist viel stärker als die Haftung der einzelsträngige Oligonukleotide (Stapelstränge). Andere positiv geladene Ionen, einschließlich Ni ²⁺ und Co ²⁺ kann die Adhäsion von DNA auf Glimmer steuern. ^6,7 Veränderung der Konzentration der ein- und zweiwertigen Kationen in Lösung kann adhe vermittelnsion und Oberflächendiffusionsraten von DNA-Origami. ⁸ jedoch das Protokoll zur Herstellung von Glimmersubstraten und Abscheiden und Spülen des Origami ist häufig nicht explizit in veröffentlichten Manuskripten. ⁹ Ohne ein klares Protokoll beschrieben, können reproduzierbare Ergebnisse nur schwer zu erhalten.

Glimmer ist ein Isolator, so dass es nicht als Substrat für einige Anwendungen in der Nanoelektronik geeignet. Silicium mit einer dünnen native Oxid passiwünschenswerte elektronische Eigenschaften, einschließlich der Kompatibilität mit früheren Komplementär-Metalloxid-Halbleiter (CMOS) Verarbeitung zur Eingabe / Ausgabe-Strukturen und topographische Merkmale zu schaffen. In Luft gelagert Siliziumscheiben sind entweder mit einem dicken thermischen Oxid oder dünne natürliche Oxidschicht, die relativ schmutzig ist, mit einer hohen Partikelzahl passiviert. Siliciumoxid hat einen viel niedrigeren Oberflächenladungsdichte als Glimmer und die Ladungsdichte ist stark abhängig von Oxid Herstellung und Geschichte. Bei Magnesiumionenkonzentrationen above 150 mM, gute Beschichtungsstärken (bis zu 4 / & mgr; m ²⁾ mit rechteckigem Origami auf Sauerstoffplasma behandelte Siliziumsubstraten erreicht werden kann; aber diese Konzentration und Abdeckung kann in Abhängigkeit von der Größe und Gestaltung der Nanostrukturen verwendet ein alternatives Protokoll für die Abstimmung der Oberflächenladung zu ändern. ¹⁰ ist, um eine kationische selbstorganisierte Monoschicht von 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES) (1B) anhängen das Oxid. Das primäre Amin auf APTES kann bei pH-Werten unter 9 protoniert werden, Modifizieren der Ladung und Hydrophobizität des Substrats. ¹¹ für eine vollständige Monoschicht von APTES erfolgreich aufgebracht werden, muss das in geeigneter Weise unter Verwendung von Silizium-Radio Corporation of America (RCA) Protokollen gereinigt werden . Diese Protokolle sind Behandlungen in Ammoniumhydroxid und Wasserstoffperoxid-Lösungen (RCA1) um organische Rückstände und Partikel-Verunreinigungen zu entfernen. Eine kurze Ätzung in wäßriger Fluorwasserstoffsäurelösung entfernt den nativen Oxidschicht zusammen mitbeliebige ionische Verunreinigungen, die in das Oxid zu haften. Schließlich werden die Proben auf eine Chlorwasserstoffsäure und Wasserstoffperoxid-Lösung (RCA2) ausgesetzt, um Metall und ionischen Verunreinigungen zu entfernen und eine dünne, gleichmäßige Oxidschicht. ¹² Die meisten Reinräume haben Hauben für CMOS Reinigungsprotokolle mit strengen Regeln darüber, was verwendet werden, bezeichnet, in diesen Bereichen. Ein häufiges Problem ist in der Form von Ionen, wie Natrium, die die elektronischen Eigenschaften des CMOS-Strukturen durch die Schaffung midbandgap Fallen stören können. ¹³ Ionen üblicherweise in DNA origami Herstellung und Ablagerung Puffer verwendet könnten die CMOS Bäder Probleme für andere Forscher, die verschmutzen und zu der Reinraum. Aus diesem Grund nutzt unsere Gruppe eine "schmutzige" CMOS Reinigung Bank für kleine Proben für DNA-Origami-Forschung speziell angeordnet. Dieser Prozess ist eine gute Alternative zu den traditionellen Reinraum Einrichtung und kann für Labors, die keinen Zugang zu einem Reinraum CMOS Bank sein.

Protocol

1. Experiment Planung und Materialvorbereitung Bestimmen das Design, Konzentration und Funktionalität der DNA-Origami, die in den Experimenten verwendet wird. 14-16 Hier verwenden wir eine DNA-Origami-Design-Rechteck in 1x TAE zubereitet / Mg 2+ Lösung (40 mM Tris-Base, 20 mM Essigsäure, 2 mM EDTA und 12 mM Magnesium-Acetat, pH 8,0). 17 Autoklaven Alle Tipps, Röhren und Behältern verwendet werden. Diese Materialien müssen alle Autoklaven kompatibel sein. <…

Representative Results

Zwei Variablen bestimmen die Berichterstattung über DNA-Origami auf dem Substrat: Konzentration der Lösung und Belichtungszeit. Die Absorptionseigenschaften der DNA Origami auf Glimmer und APTES funktionalisiertes Siliciumoxid sind zuvor berichtet worden. 13 die Beziehung zwischen der Konzentration der DNA origami in der Abscheidungslösung und die endgültige Beschichtungsstärken auf Glimmer sind in Tabelle 1 und 2 zusammengefaßt, zeigen zunehmende Konzentration Ergebnisse in die größe…

Discussion

Es gibt mehrere Schritte, die betont, um konsistente und optimale Ergebnisse zu erzielen werden müssen. Für Glimmer Proben, die nach einem strengen und gründlichen Spülen und Trocknen Regime, wie in den Schritten 3.3 und 3.4, wird sicherstellen, dass qualitativ hochwertige Bilder von einzelnen DNA-Origami kann mit AFM, ohne die verschiedenen Probleme im Repräsentative Ergebnisse Abschnitt beschrieben erreicht werden. Von primärer Bedeutung für Siliziumproben ist die Sauberkeit des Substrats. Im Anschluss an die i…

Materials

Eppendorf epT.I.P.S. Reloads, capacity 2-200 μL	VWR International, LLC	22491733	10 reload tray of 96 tips
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene	VWR International, LLC	87003-290	0.65 mL, natural
Research Plus Pippete – Single Channel – 20-200 μL	A. Daigger & Company, Inc.	EF8960F-3120000054 EACH	Adjustable Volume
Research Plus Pippete – Single Channel – 2-20 μL	A. Daigger & Company, Inc.	EF8960D-3120000038 EACH	Adjustable Volume
Scotch 237 Permanent Double-Sided Tape	Office Depot, Inc.	602710	3/4" x 300", Pack of 2
Vortex Mixer	Thermo Scientific	M37610-33Q
Wafer container single, 2" (50 mm), 60 mm x 11 mm	Electron Microscopy Sciences	64917-2	6 per pack
6" Wafer, P-type, <100> orientation, w/ primary flat	Nova Electronic Materials, Ltd.	GC49266
Powder-Free Nitrile Examination Gloves	VWR International, LLC	82062-428	Catalog number is for size large
High Accuracy Noncontact probes with Au reflective coating	K-Tek Nanotechnology, Inc.	HA_NC/15
Autoclave Pan	A. Daigger & Company, Inc.	NAL692-5000 EF25341C
Sol-Vex II Aggressive Gloves, Size: 9-9.5; 15 mil, 13 inch – 1 dz	Spectrum Chemical Mfg. Corp.	106-15055	Before use, rinse with water and scrub together until no bubbles form on the gloves.
Tweezers PTFE 200 mm Square	Dynalon Corp.	316504-0002
Muscovite Mica Sheets V-5 Quality	Electron Microscopy Sciences	71850-01	10 per pack
Mica Disc, 10 mm	Ted Pella, Inc	50	Mica discs are optional
Scriber Diamon Pen for Glassware	VWR International, LLC	52865-005
Scintillation Vials, Borosilicate Glass, with Screw Cap – 20 mL	VWR International, LLC	66022-060	Case of 500, with attached polypropylene cap and pulp foil liner
4 x 5 Inch Top PC-200 Hot Plate, 120 V/60 Hz	Dot Scientific, Inc.	6759-200
Straight-Sided Glass Jars, Wide Mouth	VWR International, LLC	89043-554	Case of 254, caps with pulp/vinyl liner attached
Standar-Grade Glass Beaker, 250 mL Capacity	VWR International, LLC	173506
Beakers, PTFE	VWR International, LLC	89026-022	For use with HF
Shallow form watch glass, 3"	VWR International, LLC	66112-107	Case of 12
Plastic Storage Container	VWR International, LLC	470195-354	For secondary container
General-Purpose Liquid-In-Glass Thermometers	VWR International, LLC	89095-564
High precision and ultra fine tweezers	Electron Microscopy Sciences	78310-0
Polycarbonate Faceshield	Fisher Scientific, Inc.	18-999-4542
Neoprene Apron	Fisher Scientific, Inc.	19-810-609
Calcium Gluconate, Calgonate	W.W Grainger, Inc.	13W861	Tube, 25 g
Hydrogen Peroxide 30 % CR ACS 500 mL	Fisher Scientific, Inc.	H325 500	HARMFUL, TOXIC
3-Aminopropyltriethoxysilane	Gelest Inc.	SIA0610.0-25GM	Let warm to room temperature before use.
Ammonium hydroxide, 2.5 L	Fisher Scientific, Inc.	A669-212	HARMFUL, TOXIC
Hydrochloric acid	Fisher Scientific, Inc.	A144-212	HARMFUL, TOXIC
Hydrofluoric acid	Fisher Scientific, Inc.	A147-1LB	HARMFUL, TOXIC
MultiMode Nanoscope IIIa	Veeco Instruments, Inc.	n/a	Any AFM capable of tapping mode is suitable for analysis
Dunk basket	Made in lab	Made in lab	The dunk basket was made using the bottom of a PTFE bottle with holes drilled in, PTFE handle, and all PTFE screws.