Preparación de Mica y Silicon Sustratos para el Análisis de Origami ADN y Experimentación

Summary

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

Abstract

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Introduction

Presentado por primera vez en 2006, el origami de ADN utiliza la naturaleza auto-ensamblaje de oligonucleótidos de ADN para producir nanoestructuras designable y altamente ordenados. ¹ Una miríada de estructuras se han reportado, que van desde caras sonrientes a enganchada cajas de 3 dimensiones. ² ADN origami se puede funcionalizar con diferentes biomoléculas y nanoestructuras, dando lugar a aplicaciones de investigación en nanoelectrónica, la medicina y la computación cuántica. ³ Sin embargo, el análisis y muchas aplicaciones futuras no dependen sólo de diseño estructural, sino también de la adhesión de las nanoestructuras de origami de ADN a las superficies. Los métodos descritos en este manuscrito se refieren a la preparación de muestras de origami de ADN en dos tipos de sustratos: mica y óxido de silicio funcionalizado.

Mica es el sustrato de elección para estudios de origami de ADN porque es atómicamente plana, con una altura de capa de 0,37 ± 0,02 nm nm. ⁴ También es EASily limpiado, por lo que la preparación de muestras y la microscopía de fuerza atómica (AFM) Estudios sencillo. Mica moscovita contiene una alta densidad de potasio en cada plano de escisión, pero estos iones se difunden fuera de la superficie de mica cuando en el agua. Para mediar en la unión de origami de ADN al sustrato mica, Mg ²⁺ se utiliza para invertir la carga negativa de la mica y se unen electrostáticamente el esqueleto de fosfato del ADN al sustrato (Figura 1A). ⁵ Las mezclas de ADN recocido en presencia de gran excesos de hilos básicos dan una alta cobertura y buenas imágenes en la mica, porque la adhesión de origami de ADN a la superficie ²⁺ -terminated Mg es mucho más fuerte que la adhesión de oligonucleótidos de cadena sencilla (hebras de primera necesidad). Otros iones cargados positivamente, incluyendo Ni y Co ^{2+ 2+} se pueden utilizar para controlar la adherencia de ADN en mica. ^6,7 Cambio de la concentración de cationes monovalentes y divalentes en solución puede mediar adhetasas de origami de ADN sión y difusión superficial. ⁸ Sin embargo, el protocolo para la preparación de sustratos de mica y depositar y enjuagar el origami a menudo no se describe explícitamente en los manuscritos publicados. ⁹ Sin un protocolo claro, resultados reproducibles pueden ser difíciles de obtener.

La mica es un aislante, por lo que no es adecuado como sustrato para algunas aplicaciones en nanoelectrónica. Silicio pasivado con un óxido nativo delgada tiene propiedades electrónicas deseables, incluida la compatibilidad con el procesamiento antes de semiconductor de óxido de metal de cortesía (CMOS) para crear estructuras de entrada / salida y las características topográficas. Las obleas de silicio almacenados en el aire se pasivan ya sea con un óxido térmico de espesor o película delgada de óxido nativo que es relativamente sucio, con un alto número de partículas. El óxido de silicio tiene una densidad de carga superficial mucho más baja que la mica, y la densidad de carga es altamente dependiente de la preparación de óxido y la historia. En las concentraciones de iones de magnesio above 150 mM, buenas coberturas (hasta 4 / m ²⁾ de origami de ADN rectangular se puede lograr sobre sustratos de silicio de plasma tratado de oxígeno; sin embargo, esta concentración y la cobertura pueden cambiar dependiendo del tamaño y el diseño de las nanoestructuras que se utiliza. ¹⁰ Un protocolo alternativo para el ajuste de la carga superficial es adjuntar un auto-ensamblado monocapa catiónica de 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) (Figura 1B) a el óxido. La amina primaria en APTES puede estar protonado a valores de pH por debajo de 9, la modificación de la carga y la hidrofobicidad del sustrato. ¹¹ Para una monocapa completa de APTES para ser depositado con éxito, el silicio debe ser limpiado apropiadamente utilizando protocolos (RCA) Radio Corporation of America . Estos protocolos incluyen tratamientos en hidróxido de amonio y soluciones de peróxido de hidrógeno (RCA1) para eliminar los residuos orgánicos y los contaminantes de partículas. Un corto grabado en solución acuosa de ácido fluorhídrico elimina la capa de óxido nativo junto concualesquiera contaminantes iónicos que se adhieren al óxido. Finalmente, las muestras se exponen a una solución de ácido clorhídrico y peróxido de hidrógeno (RCA2) para eliminar el metal y contaminantes iónicos y formar una capa de óxido delgada, uniforme. ¹² La mayoría de salas blancas han designado capuchas para protocolos de limpieza CMOS, con reglas estrictas sobre lo que se puede utilizar en estas áreas. Un problema común viene en la forma de iones tales como sodio, que pueden alterar las propiedades electrónicas de estructuras CMOS mediante la creación de trampas midbandgap. ¹³ Los iones comúnmente utilizado en origami de ADN de preparación y deposición tampones podría contaminar los baños CMOS y causar problemas para otros investigadores utilizando la habitación limpia. Por esta razón, nuestro grupo utiliza un CMOS 'sucias' banco de limpieza dispuestos específicamente para las pequeñas muestras utilizadas para la investigación de origami de ADN. Este proceso es una buena alternativa a la sala blanca tradicional puesta a punto y puede ser adecuado para laboratorios que no tienen acceso a un banco de CMOS de sala limpia.

Protocol

Planificación 1. Experimentar y Preparación de materiales Determinar el diseño, la concentración, y la funcionalidad del origami de ADN que será usado en los experimentos. 14-16 Aquí, nosotros usamos un diseño ADN origami rectángulo preparado en 1x TAE / solución de Mg 2+ (40 mM Tris-base, 20 mM ácido acético, EDTA 2 mM y 12 mM acetato de magnesio, pH 8,0). 17 Autoclave todos los consejos, tubos y envases usados ​​para ser utilizado. Estos materiales d…

Representative Results

Dos variables determinan la cobertura de origami de ADN en el sustrato: concentración de la solución y tiempo de exposición. Las características de adsorción de origami de ADN en mica y APTES óxido de silicio funcionalizado se ha informado anteriormente. 13 La relación entre la concentración de origami de ADN en la solución de deposición y las coberturas finales sobre mica se resumen en la Tabla 1 y la Figura 2, que muestra el aumento de los resultados de concentrac…

Discussion

Hay varios pasos que hay que hacer hincapié para lograr resultados consistentes y ideales. Para las muestras de mica, siguiendo un estricto y enjuague a fondo y secado régimen, como en los pasos 3.3 y 3.4, se asegurará de que las imágenes de alta calidad de origami de ADN individuales pueden alcanzarse mediante AFM sin los diversos problemas descritos en la sección de Resultados Representante. De importancia primaria para muestras de silicio es la limpieza del sustrato. Siguiendo los procedimientos de limpieza desc…

Materials

Eppendorf epT.I.P.S. Reloads, capacity 2-200 μL	VWR International, LLC	22491733	10 reload tray of 96 tips
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene	VWR International, LLC	87003-290	0.65 mL, natural
Research Plus Pippete – Single Channel – 20-200 μL	A. Daigger & Company, Inc.	EF8960F-3120000054 EACH	Adjustable Volume
Research Plus Pippete – Single Channel – 2-20 μL	A. Daigger & Company, Inc.	EF8960D-3120000038 EACH	Adjustable Volume
Scotch 237 Permanent Double-Sided Tape	Office Depot, Inc.	602710	3/4" x 300", Pack of 2
Vortex Mixer	Thermo Scientific	M37610-33Q
Wafer container single, 2" (50 mm), 60 mm x 11 mm	Electron Microscopy Sciences	64917-2	6 per pack
6" Wafer, P-type, <100> orientation, w/ primary flat	Nova Electronic Materials, Ltd.	GC49266
Powder-Free Nitrile Examination Gloves	VWR International, LLC	82062-428	Catalog number is for size large
High Accuracy Noncontact probes with Au reflective coating	K-Tek Nanotechnology, Inc.	HA_NC/15
Autoclave Pan	A. Daigger & Company, Inc.	NAL692-5000 EF25341C
Sol-Vex II Aggressive Gloves, Size: 9-9.5; 15 mil, 13 inch – 1 dz	Spectrum Chemical Mfg. Corp.	106-15055	Before use, rinse with water and scrub together until no bubbles form on the gloves.
Tweezers PTFE 200 mm Square	Dynalon Corp.	316504-0002
Muscovite Mica Sheets V-5 Quality	Electron Microscopy Sciences	71850-01	10 per pack
Mica Disc, 10 mm	Ted Pella, Inc	50	Mica discs are optional
Scriber Diamon Pen for Glassware	VWR International, LLC	52865-005
Scintillation Vials, Borosilicate Glass, with Screw Cap – 20 mL	VWR International, LLC	66022-060	Case of 500, with attached polypropylene cap and pulp foil liner
4 x 5 Inch Top PC-200 Hot Plate, 120 V/60 Hz	Dot Scientific, Inc.	6759-200
Straight-Sided Glass Jars, Wide Mouth	VWR International, LLC	89043-554	Case of 254, caps with pulp/vinyl liner attached
Standar-Grade Glass Beaker, 250 mL Capacity	VWR International, LLC	173506
Beakers, PTFE	VWR International, LLC	89026-022	For use with HF
Shallow form watch glass, 3"	VWR International, LLC	66112-107	Case of 12
Plastic Storage Container	VWR International, LLC	470195-354	For secondary container
General-Purpose Liquid-In-Glass Thermometers	VWR International, LLC	89095-564
High precision and ultra fine tweezers	Electron Microscopy Sciences	78310-0
Polycarbonate Faceshield	Fisher Scientific, Inc.	18-999-4542
Neoprene Apron	Fisher Scientific, Inc.	19-810-609
Calcium Gluconate, Calgonate	W.W Grainger, Inc.	13W861	Tube, 25 g
Hydrogen Peroxide 30 % CR ACS 500 mL	Fisher Scientific, Inc.	H325 500	HARMFUL, TOXIC
3-Aminopropyltriethoxysilane	Gelest Inc.	SIA0610.0-25GM	Let warm to room temperature before use.
Ammonium hydroxide, 2.5 L	Fisher Scientific, Inc.	A669-212	HARMFUL, TOXIC
Hydrochloric acid	Fisher Scientific, Inc.	A144-212	HARMFUL, TOXIC
Hydrofluoric acid	Fisher Scientific, Inc.	A147-1LB	HARMFUL, TOXIC
MultiMode Nanoscope IIIa	Veeco Instruments, Inc.	n/a	Any AFM capable of tapping mode is suitable for analysis
Dunk basket	Made in lab	Made in lab	The dunk basket was made using the bottom of a PTFE bottle with holes drilled in, PTFE handle, and all PTFE screws.