Utarbeidelse av Mica og Silicon Underlag for DNA Origami analyse og eksperimentering

Summary

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

Abstract

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Introduction

Først introdusert i 2006, benytter DNA origami selv montering natur DNA-oligonukleotider å produsere utformbare og svært bestilte nanostrukturer. ¹ En myriade av strukturer har blitt rapportert, alt fra smilefjes til låst 3-dimensjonale bokser. ² DNA origami kan funksjon med ulike biomolekyler og nanostrukturer, noe som gir opphav til forskningssøknader i nanoelektronikk, medisin og quantum computing. ³ Men analysen og mange fremtidige programmer er ikke bare avhengig av strukturelle design, men også på vedheft av DNA origami nanostrukturer til overflater. Metodene som beskrives i dette manuskriptet gjelder for fremstillingen av DNA-origami prøver på to typer substrater: glimmer og funksjonaliseres silisiumoksid.

Glimmer er substratet grepet av DNA origami studier fordi det er atomisk flat, med en laghøyde på 0,37 nm ± 0,02 nm. ⁴ er det også easily rengjort, noe som gjør atomic force mikroskopi (AFM) studier prøveopparbeidelse og grei. Muskovitt glimmer inneholder en høy tetthet av kalium i hver spalting fly, men disse ioner diffunderer bort fra glimmer flaten når den er i vann. For å mediere binding av DNA origami til glimmer substratet, blir Mg ²⁺ brukes til å reversere den negative ladningen av glimmer og elektrostatisk binde DNA-fosfat-hovedkjeden til substratet (figur 1A). ⁵ Blandinger av hybridiserte DNA i nærvær av store overskudd av stapel- tråder gir høy dekningsgrad og gode bilder på glimmer på grunn av adhesjonen av DNA origami til Mg ²⁺ -terminated overflate er mye sterkere enn adhesjonen av enkelt-trådede oligonukleotider (stapel- tråder). Andre positivt ladede ioner, inkludert Ni ^{2+ 2+} Co og kan brukes til å kontrollere adhesjonen av DNA på glimmer. ^6,7 Endring av konsentrasjonen av monovalente og divalente kationer i oppløsning kan mediere adhesjons og overflate diffusjonshastigheter av DNA origami. ⁸ imidlertid protokollen for fremstilling av glimmer substrater og avsette og skylle origami er ofte ikke eksplisitt er beskrevet i publiserte manuskripter. ⁹ Uten klar-protokollen, kan reproduserbare resultater være vanskelig å oppnå.

Glimmer er en isolator, slik at det ikke er egnet som substrat for enkelte applikasjoner i nanoelektronikk. Silicon passiv med et tynt innfødt oksid har attraktive elektroniske egenskaper, inkludert kompatibilitet med tidligere gratis Metal Oxide Semiconductor (CMOS) behandling for å lage input / output strukturer og topografiske egenskaper. Silisiumskiver som er lagret i luft er passivert med enten en tykk termisk oksyd eller tynn innfødt oksid film som er relativt skittent, med en høy partikkeltelling. Silisium-oksyd har en mye lavere tetthet enn overflateladning glimmer, og ladningstettheten er svært avhengig av oksyd forberedelse og historie. På magnesium ionekonsentrasjoner above 150 mM, god dekning (opp til 4 / um ²⁾ med rektangulært DNA origami kan oppnås på oksygenplasma behandles silisiumsubstrater; Dette kan imidlertid konsentrasjonen og dekning endres avhengig av størrelsen og utformingen av nanostrukturer som brukes. ¹⁰ En alternativ protokoll for tuning overflaten kostnad er å feste en kationiske selv-montert monolayer av 3-aminopropyltrietoksysilan (APTES) (figur 1B) til oksydet. Det primære amin på APTES kan bli protonert ved pH-verdier under 9, modifisering av ladning og hydrofobisitet av underlaget. ¹¹ For en fullstendig monolag av APTES å være vellykket avsettes, må silisium være hensiktsmessig renses ved hjelp av Radio Corporation of America (RCA) protokoller . Disse protokoller inkluderer behandlinger i ammoniumhydroksyd og hydrogenperoksydoppløsninger (RCA1) for å fjerne organiske rester og partikkel forurensninger. En kort etch i vandig flussyre-løsning, fjernes det naturlige oksydlag sammen mednoen ioniske forurensninger som holder seg til oksid. Til slutt, er prøvene utsatt for en saltsyre og hydrogen peroxide løsning (RCA2) for å fjerne metall og ioniske forurensninger og danner en tynn, jevn oksydlaget. ¹² De fleste renrom har utpekt hetter for CMOS rengjøring protokoller, med strenge regler om hva som kan brukes i disse områdene. Et vanlig problem kommer i form av ioner slik som natrium, som kan forstyrre de elektroniske egenskaper av CMOS-strukturer ved å lage midbandgap feller. ¹³ Ioner som vanligvis anvendes i DNA origami forberedelse og deponering buffere kan forurense CMOS-bad og føre til problemer for andre forskere ved hjelp clean room. Av denne grunn, vår gruppe bruker en "skitne" CMOS rengjøring benk arrangert spesielt for de små prøver som brukes til DNA origami forskning. Denne prosessen er et godt alternativ til den tradisjonelle renrom oppsett og kan være egnet for laboratorier som ikke har tilgang til et renrom CMOS benk.

Protocol

1. Eksperimenter Planlegging og Material Forberedelse Bestem utforming, konsentrasjon, og funksjonaliteten av DNA origami som vil bli anvendt i eksperimentene. 14-16 Her anvendes en DNA origami rektangel utforming fremstilt i 1 x TAE / Mg2 +-oppløsning (40 mM Tris-base, 20 mM eddiksyre, 2 mM EDTA og 12 mM magnesium-acetat, pH 8,0). 17 Autoklav alle tips, rør og containere som skal brukes. Disse materialene må alle være autoklav kompatible. Forberede en …

Representative Results

To variabler diktere dekning av DNA origami på substratet: Løsning konsentrasjon og eksponeringstid. Absorpsjons egenskapene DNA origami på glimmer og APTES funksjonalisert silisiumoksyd er tidligere blitt rapportert. 13 Forholdet mellom konsentrasjonen av DNA origami i avsetningsoppløsningen og de ​​endelige dekning på glimmer er oppsummert i tabell 1 og figur 2, og viser økende konsentrasjon resultatene i økt dekning. Den tidsavhengighet av binding er sett i <str…

Discussion

Det er flere tiltak som må vektlegges for å oppnå konsistente og ideelle resultater. For glimmer prøver, etter en streng og grundig skylling og tørking regime, som i trinn 3.3 og 3.4, vil sørge for at bilder av høy kvalitet av individuelle DNA origami kan oppnås ved hjelp av AFM uten de ulike problemene skissert i representative resultater delen. Av særlig betydning for silisium prøvene er renslighet av underlaget. Etter rengjøring prosedyrene beskrevet i trinn 5.2 grundig og omhyggelig vil sikre at en hensik…

Materials

Eppendorf epT.I.P.S. Reloads, capacity 2-200 μL	VWR International, LLC	22491733	10 reload tray of 96 tips
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene	VWR International, LLC	87003-290	0.65 mL, natural
Research Plus Pippete – Single Channel – 20-200 μL	A. Daigger & Company, Inc.	EF8960F-3120000054 EACH	Adjustable Volume
Research Plus Pippete – Single Channel – 2-20 μL	A. Daigger & Company, Inc.	EF8960D-3120000038 EACH	Adjustable Volume
Scotch 237 Permanent Double-Sided Tape	Office Depot, Inc.	602710	3/4" x 300", Pack of 2
Vortex Mixer	Thermo Scientific	M37610-33Q
Wafer container single, 2" (50 mm), 60 mm x 11 mm	Electron Microscopy Sciences	64917-2	6 per pack
6" Wafer, P-type, <100> orientation, w/ primary flat	Nova Electronic Materials, Ltd.	GC49266
Powder-Free Nitrile Examination Gloves	VWR International, LLC	82062-428	Catalog number is for size large
High Accuracy Noncontact probes with Au reflective coating	K-Tek Nanotechnology, Inc.	HA_NC/15
Autoclave Pan	A. Daigger & Company, Inc.	NAL692-5000 EF25341C
Sol-Vex II Aggressive Gloves, Size: 9-9.5; 15 mil, 13 inch – 1 dz	Spectrum Chemical Mfg. Corp.	106-15055	Before use, rinse with water and scrub together until no bubbles form on the gloves.
Tweezers PTFE 200 mm Square	Dynalon Corp.	316504-0002
Muscovite Mica Sheets V-5 Quality	Electron Microscopy Sciences	71850-01	10 per pack
Mica Disc, 10 mm	Ted Pella, Inc	50	Mica discs are optional
Scriber Diamon Pen for Glassware	VWR International, LLC	52865-005
Scintillation Vials, Borosilicate Glass, with Screw Cap – 20 mL	VWR International, LLC	66022-060	Case of 500, with attached polypropylene cap and pulp foil liner
4 x 5 Inch Top PC-200 Hot Plate, 120 V/60 Hz	Dot Scientific, Inc.	6759-200
Straight-Sided Glass Jars, Wide Mouth	VWR International, LLC	89043-554	Case of 254, caps with pulp/vinyl liner attached
Standar-Grade Glass Beaker, 250 mL Capacity	VWR International, LLC	173506
Beakers, PTFE	VWR International, LLC	89026-022	For use with HF
Shallow form watch glass, 3"	VWR International, LLC	66112-107	Case of 12
Plastic Storage Container	VWR International, LLC	470195-354	For secondary container
General-Purpose Liquid-In-Glass Thermometers	VWR International, LLC	89095-564
High precision and ultra fine tweezers	Electron Microscopy Sciences	78310-0
Polycarbonate Faceshield	Fisher Scientific, Inc.	18-999-4542
Neoprene Apron	Fisher Scientific, Inc.	19-810-609
Calcium Gluconate, Calgonate	W.W Grainger, Inc.	13W861	Tube, 25 g
Hydrogen Peroxide 30 % CR ACS 500 mL	Fisher Scientific, Inc.	H325 500	HARMFUL, TOXIC
3-Aminopropyltriethoxysilane	Gelest Inc.	SIA0610.0-25GM	Let warm to room temperature before use.
Ammonium hydroxide, 2.5 L	Fisher Scientific, Inc.	A669-212	HARMFUL, TOXIC
Hydrochloric acid	Fisher Scientific, Inc.	A144-212	HARMFUL, TOXIC
Hydrofluoric acid	Fisher Scientific, Inc.	A147-1LB	HARMFUL, TOXIC
MultiMode Nanoscope IIIa	Veeco Instruments, Inc.	n/a	Any AFM capable of tapping mode is suitable for analysis
Dunk basket	Made in lab	Made in lab	The dunk basket was made using the bottom of a PTFE bottle with holes drilled in, PTFE handle, and all PTFE screws.