طريقة دراسة حلقي فيوجن باستخدام ثابت الجهاز الثقافة
Summary
هي الدافع دراسات التنمية الحنك قبل حدوث الشق الحلقي وهو عيب خلقي الذي يفرض عبئا صحية هائلة، ويمكن أن يترك تشوهات دائمة. علينا أن نظهر هنا تقنية لرفوف الثقافة حنكي التي يمكن استخدامها لدراسة مسارات الإشارات المختلفة المشاركة في التنمية حنكي والانصهار.
Abstract
الشفة المشقوقة والحنك هي من بين الأكثر شيوعا من جميع العيوب الخلقية. أشكال الحنك الثانوية من الرفوف الوسيطة مغطاة ظهارة أن تلتزم تشكل خط التماس خط الوسط الظهارية (MES). النظريات تشير إلى أن الخلايا MES اتباع الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT)، موت الخلايا المبرمج والهجرة، مما يجعل الحنك تنصهر 1. تفكك كامل للMES هو المرحلة الأساسية النهائية للحنكي التقاء مع توضيح خلايا اللحمة المتوسطة. ونحن نقدم طريقة لثقافة الجهاز الحنك. الدول المتقدمة في بروتوكول المختبر يسمح للدراسة العمليات البيولوجية والجزيئية خلال الانصهار. تطبيقات هذه التقنية متعددة، بما في ذلك تقييم الردود على العوامل الكيميائية خارجي، وآثار العوامل التنظيمية والنمو وبروتينات معينة. الثقافة الجهاز الحنك لديها عدد من المزايا بما في ذلك التلاعب في مراحل مختلفة من التنمية لم يكن ذلك ممكنا باستخدام الدراسات المجراة.
Introduction
انشقاقات فموي وجهي هي الاكثر السائدة العيوب الخلقية القحفي. أيضا، مع الأخذ في الاعتبار جميع العيوب القحفي ممكنة، وهذه هي ثاني الشذوذ الولادة الأكثر شيوعا في الأطفال حديثي الولادة 2. تحدث الأذواق المشقوقة في حوالي 1 في كل 700 ولادة في الولايات المتحدة (US) من كل عام، وقوع الحنك يساوي 475 الأطفال الذين ولدوا مع الأذواق المشقوقة شهريا أو 15 طفلا شقوقا في يوم 3. ما يقرب من 1٪ من الأطفال الذين ولدوا في جميع أنحاء العالم كل عام المعرض شكلا من أشكال dysmorphology القحفي.
شقوق في سقف الحلق والشفة تحتاج إلى إجراء مكلفة جدا ومعقدة مع تداعيات مدى الحياة للمرضى الذين لديهم هذا الشذوذ. التكلفة التقديرية لكل مريض مع شق طريق الفم هو حوالي 100،000 $ 4. علاج للمريض مع الشفة المشقوقة والحنك يتطلب فريقا من الأطباء الجراحين بما في ذلك القحفي، otolaryngologists، والهندسة الوراثية، التخدير،النطق واللغة الأطباء وخبراء التغذية، تقويم الأسنان، prosthodontists وعلماء النفس والأعصاب، وأطباء العيون.
في palatogenesis، ينشأ الحنك الثانوي الامتداد المقترنة، التي تنمو في البداية عموديا والخضوع لحنكي الرف الارتفاع فوق ظهر اللسان. بعد الارتفاع، ورفوف حنكي يقترن تنمو نحو خط الوسط (في E14.5 -E15 في الفئران والأسبوع 9 في البشر). ظهارة حافة وسطي (MEE) الذي يغطي طرف الجرف تلتزم تشكيل التماس خط الوسط الظهارية.
ويعقب ذلك الظهارية للانتقال الوسيطة و / أو موت الخلايا المبرمج للسماح الوسيطة التقاء. التصاق معارضة MEE هو الحدث الأساسي الذي يسبب الحنك التغيير. ومع ذلك، حققت فقط عدد قليل من الدراسات التصاق الأولي من الرفوف حنكي 5. أشكال الحنك الصلبة التي تمايز خلايا اللحمة المتوسطة في بناء العظم. تطوير شاذة من الحنك يمكن أن تنتج المفتاحر الأذواق مع أو دون تدخل من الشفة.
وقد استخدمت تقنيات زراعة الأعضاء الحنك على نطاق واسع لكثير من المختبرات على مدى السنوات ال 30 الماضية 6،7.
في هذا البروتوكول وصفنا في تفاصيل طريقة لتشريح حنكي والثقافة الجهاز ثابتة. الاستفادة من ثقافة بلا حراك الجهاز هو أنه يتيح الرفوف الحنك لتلتحم. وقد استخدمت هذه التقنية بنجاح في المختبر لدينا لكثير من الانصهار ويشير التجارب 8،9. إلا أن نطاق هذه التقنية واسع ويمكن استخدامها كلما مطلوب نظام الثقافة الجهاز ثابتة، بما في ذلك تقييم الاستجابات لعوامل كيميائية خارجي، وآثار عوامل النمو التنظيمية في مسارات مختلفة، وبروتينات معينة.
الشكل 1. ماوس Palatogenesis. مراحل تطور الحنك الفئران. (BF) الضوئي ايلىالميكروسكوب ctron (SEM) من الحنك الثانوي في فترات النمو التمثيلية. السهام الحمراء: وتظهر بالجزء الأول من التصاق حنكي والانصهار. الأسهم الصفراء: أشر إلى الفضاء بين أذواق الابتدائية والثانوية التي سوف تختفي بعد الانصهار (نقلا عن كوفمان 11 بإذن من بلوس وان).
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول في هذه المقالة يوفر طريقة لتشريح الرفوف حنكي من الأجنة في اليوم الجنينية 13.5. وكانت الرفوف الحنك من أجنة الفئران مثقف في وسائل الإعلام ثقافة خالية من مصل في جو من 95٪ O 2 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. نجاح حنكي تشريح اعتمادا كبيرا على عوامل متعددة في كل خطوة …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors do not have any acknowledgements.
Materials
| BGJb | Invitrogen | ||
| Penicillin/Streptomycin | Lonza Inc. | 17-602E | 100X |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | 100x15mm |
| Center-well organ culture dish | Falcon | #353037 | 60×15 mm |
| Wire triangular grid | Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well. | ||
| Polycarbonate filter | GE& Water and Process Technologies | K04BP04700 | Black 0.4 micron, 47 mm |
| Stereo microscope | ZEISS Stemi SR | ||
| Culture hood | NUAIRE Laminar Flow | ||
| Microdissecting forceps | Dumont Medical | #5 | |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS14003-G | Vannas Scissors, straight, 8cm long, 0.1mm tips, 5mm blades, German made |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS500086 | Vannas Scissors, straight, 8.5cm long, 0.025mm x 0.015mm tips, 7mm blades |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS14127-G | Spring scissors curved curved, 10.5cm long, 8mm blades, German made |
| Surgical currete (spoon spatula) | Hu-friedy | CM 2/4 | |
| Protector laboratory hood | Labconco | ||
| Incubator | Thermo Scientific | Farma | |
| Series11 water Jacket | |||
| Co2 incubator | |||
| PBS | GIBCO | 10010-023 | 1X |
| Fiber optic Light source | Fiber-light Dolan-Jenner | PL-750 | |
| Embedding cassette | Statlab | EC301 | |
| Kim Wipes | VWR | 470173-504 | |
References
- Nawshad, A. Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).
- Strong, E. B., Buckmiller, L. M. Management of the cleft palate. Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).
- Witt, P. D., Marsh, J. L. Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate. Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).
- 4miloro, . principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).
- Mima, J. Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation. PloS one. 8, e61653 (2013).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy. Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).
- Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos. The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).
- San Miguel, S. Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).
- Kang, P., Svoboda, K. K. PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).
- RD, L. . Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. , (1965).
- Kaufman, M. H. . The Atlas of Mouse Development. , (1992).
- Taher, L. Global gene expression analysis of murine limb development. PloS one. 6, e28358 (2011).
