Methode der Untersuchung Palatal Fusion mit statischen Organ Culture
Summary
Studium der Gaumen Entwicklung werden durch das Auftreten von Gaumenspalte, einem Geburtsfehler, die eine enorme gesundheitliche Belastung auferlegt und hinterlassen bleibende Entstellung motiviert. Wir zeigen hier eine Technik zur Kultur palatinalen Regalen, die verwendet werden können, um verschiedene Signalwege in palatinalen Entwicklung und Fusion studieren.
Abstract
Lippen- und Gaumenspalte gehören zu den am häufigsten von allen Geburtsfehler. Die sekundären Gaumen Formen aus mesenchymalen Regale mit Epithel bedeckt, die die Mittellinie epithelialen Naht haftet (MES). Die Theorien besagen, dass MES-Zellen folgen eine epitheliale zu mesenchymale Transition (EMT), Apoptose und Migration, so dass ein fusioniertes Gaumen 1. Vollständigen Zerfall der MES ist die letzte wesentliche Phase der Gaumenzusammenfluss mit umliegenden mesenchymalen Zellen. Wir stellen ein Verfahren zum Gaumen Organkultur. Die in vitro-Protokoll entwickelt, ermöglicht die Erforschung der biologischen und molekularen Prozesse bei der Fusion. Die Anwendungen dieser Technik sind zahlreich, darunter Auswertung der Antworten auf exogene chemische Mittel, die Auswirkungen der regulatorischen und Wachstumsfaktoren und spezifische Proteine. Palatinalen Organkultur hat eine Reihe von Vorteilen, einschließlich Manipulation in unterschiedlichen Stadien der Entwicklung, die nicht mit in vivo-Studien ist möglich.
Introduction
Gesichtsspalten sind die vorherrschenden kraniofaziale Missbildungen. Auch bei Berücksichtigung aller möglichen kraniofazialen Defekten, dies sind die zweithäufigste Geburt Anomalien bei Neugeborenen 2. Gaumenspalten bei ungefähr 1 in jeden 700 Geburten in den Vereinigten Staaten (US) jedes Jahr auftreten, ist die Inzidenz von Gaumenspalte gleich 475 Kinder mit Gaumenspalten pro Monat oder 15 Kinder mit Spalten pro Tag 3 geboren. Etwa 1% der Kinder geboren auf der ganzen Welt jedes Jahr weisen irgendeine Form von kraniofazialen Dysmorphien.
Klüften des Gaumens und der Lippen brauchen einen sehr teuren und komplizierten Verfahren mit lebenslangen Folgen für die Patienten, die diese Anomalie haben. Die geschätzten Kosten für jeden Patienten mit oralen Spalt beträgt ca. 100.000 $ 4. Die Behandlung eines Patienten mit Lippen- und Gaumenspalte erfordert ein Team von Ärzten einschließlich Schädelchirurgen, HNO-Ärzte, Genetiker, Anästhesisten,Logopäden, Ernährungswissenschaftler, Kieferorthopäden, Zahntechniker, Psychologen, Neurochirurgen und Augenärzten.
In palatogenesis, stellt sich die sekundären Gaumen gepaart Auswüchse, die ursprünglich vertikal wachsen und unterziehen Gaumenregal Höhe über den Zungenrücken. Nach der Erhebung, wachsen die paarigen Gaumen Regalen in Richtung der Mittellinie (bei E14.5 -E15 bei Mäusen und Woche 9 bei Menschen). Der mediale Rand Epithel (MEE), die die Lagerspitze deckt haftet Bildung der Mittellinie epithelialen Naht.
Dies wird durch epitheliale zu mesenchymale Transition und / oder Apoptose gefolgt, um mesenchymale Fluss zu ermöglichen. Haftung der gegenüberliegenden MEE ist ein wesentliches Ereignis, dessen Veränderung bewirkt, Gaumenspalte. Allerdings untersucht nur wenige Studien, die Anfangshaftung der Gaumen Regalen 5. Die harten Gaumen Formen durch Differenzierung von mesenchymalen Zellen in Osteoblasten. Die abnorme Entwicklung des Gaumens können Schlüssel zu erzeugent Gaumen mit oder ohne Beteiligung der Lippe.
Gaumen Organkulturtechniken hatte weithin für viele Labors in den letzten 30 Jahren 6,7 verwendet.
In diesem Protokoll beschreiben wir im Detail ein Verfahren zur Gaumen Dissektion und statischer Organkultur. Der Vorteil eines bewegungsOrganKultur ist, dass es Gaumen Regalen zu verschmelzen. Diese Technik war erfolgreich in unserem Labor für viele Fusion und Signalisierung Experimenten 8,9 verwendet. Aber der Schutzumfang der Technik ist beträchtlich und kann verwendet werden, wann immer statische Organkultursystem erforderlich ist, einschließlich der Bewertung der Reaktionen auf exogene chemische Mittel sein, die Auswirkungen regulatorischer Wachstumsfaktoren in verschiedenen Bahnen und bestimmten Proteinen.
Abbildung 1. Maus Palatogenesis. Entwicklungsstadien der Mäuse Gaumen. (BF) Scanning elecTRON Mikroskopische Aufnahmen (SEM) der Sekundär Gaumen an repräsentativen Entwicklungszeiten. Rote Pfeile: zeigen den Anfangsteil der Gaumen Adhäsion und Fusion. Gelbe Pfeile: Punkt, um den Raum zwischen den primären und sekundären Gaumen, die nach der Fusion verschwinden (nachgedruckt von Kaufman 11 mit Genehmigung von PLoS ONE).
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll in diesem Artikel stellt ein Verfahren zum Präparieren Gaumen Regalen von Embryonen im embryonalen Tag 13,5. Palatinalen Regalen aus Mausembryonen wurden in einem Serum-freien Kulturmedien in einer Atmosphäre von 95% O 2 5% CO 2 bei 37 ° C. Erfolgreiche palatinalen Dissektion ist kritisch abhängig von mehreren Faktoren in jedem Schritt während des Verfahrens aus dem embryonalen Zeit der Mäuse euthanasiert zu der Beendigung der Kultur. Einer der wichtigsten Faktoren für Gaumenfu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors do not have any acknowledgements.
Materials
| BGJb | Invitrogen | ||
| Penicillin/Streptomycin | Lonza Inc. | 17-602E | 100X |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | 100x15mm |
| Center-well organ culture dish | Falcon | #353037 | 60×15 mm |
| Wire triangular grid | Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well. | ||
| Polycarbonate filter | GE& Water and Process Technologies | K04BP04700 | Black 0.4 micron, 47 mm |
| Stereo microscope | ZEISS Stemi SR | ||
| Culture hood | NUAIRE Laminar Flow | ||
| Microdissecting forceps | Dumont Medical | #5 | |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS14003-G | Vannas Scissors, straight, 8cm long, 0.1mm tips, 5mm blades, German made |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS500086 | Vannas Scissors, straight, 8.5cm long, 0.025mm x 0.015mm tips, 7mm blades |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS14127-G | Spring scissors curved curved, 10.5cm long, 8mm blades, German made |
| Surgical currete (spoon spatula) | Hu-friedy | CM 2/4 | |
| Protector laboratory hood | Labconco | ||
| Incubator | Thermo Scientific | Farma | |
| Series11 water Jacket | |||
| Co2 incubator | |||
| PBS | GIBCO | 10010-023 | 1X |
| Fiber optic Light source | Fiber-light Dolan-Jenner | PL-750 | |
| Embedding cassette | Statlab | EC301 | |
| Kim Wipes | VWR | 470173-504 | |
References
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