Sandwich-lignende mikromiljøer at udnytte Cell / Materiale Interactions
Summary
The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.
Abstract
Cellekultur er traditionelt blevet udført på bi-dimensional (2D) substrater, hvor celler adhærerer ved hjælp ventrale receptorer til biomaterialeoverfladen. Dog in vivo, de fleste af cellerne er helt omgivet af den ekstracellulære matrix (ECM), hvilket resulterer i en tredimensional (3D) fordeling af receptorer. Dette kan udløse forskelle i udenfor-i signalveje og således i celle adfærd.
Denne artikel viser, at stimulere dorsale receptorer af celler, der allerede klæbet til en 2D substrat ved overlejring en film af et nyt materiale (en sandwich-lignende kultur) udløser vigtige ændringer i forhold til standard 2D kulturer. Desuden samtidig excitation af ventrale og dorsale receptorer skifter celle adfærd tættere på det, der findes i 3D-miljøer. Derudover, på grund af karakteren af systemet, en sandwich-lignende kultur er et alsidigt værktøj, der tillader studiet af forskellige parametre i celle / materiale interactions, fx topografi, stivhed og forskellige protein belægninger ved både den ventrale og dorsale sider. Endelig da sandwich-lignende kulturer er baseret på 2D substrater, flere analyseprocedurer allerede udviklet til standard 2D kulturer kan bruges normalt, overvinde mere komplekse procedurer, der er nødvendige for 3D-systemer.
Introduction
Traditionelt har cellekultur blevet udført på bi-dimensional (2D) substrater, selvom de fleste af de in vivo cellulære mikromiljøer har en tre-dimensional (3D) natur. Denne unaturlige 2D miljø udløser ændringer i celle adfærd som en måde selv-tilpasning til en flad verden, som direkte påvirker celle skæbne 1,2. Derfor opnåede resultater på 2D cellekulturer er ikke altid reproducerbare in vivo. Dette har fremmet udviklingen af nye relevante dyrkningssystemer, der søger at give flere fysiologiske-lignende betingelser for at få yderligere indsigt i enhver dimension-afhængig biologisk mekanisme 3,4.
En af de væsentligste forskelle mellem 2D kultur og 3D in vivo miljø er fordelingen af cellereceptorer forankret til den ekstracellulære matrix (ECM): henviser 2D på substrater adhærerer ventralt, er de fleste af celler in vivo helt omgivet af ECM og dermed cell adhæsion sker gennem et 3D fordeling af receptorer. Dette udløser forskellige celleadhæsion signalveje derved modulerer vigtige processer såsom cellevækst, celledifferentiering og genekspression. I løbet af de sidste årtier, har mange forskellige 3D dyrkningssystemer etableret 5-8, selvom deres variabilitet og kompleksitet hindre deres standardisering kultur procedurer fælles celle. Endvidere 3D-systemer er normalt ikke let at håndtere og aktuelle eksperimentelle procedurer på 2D substrater ikke let kan etableres for 3D-kulturer. Desuden litteratur sjældent sammenligner 3D kulturer med tilsvarende 2D tilstand eller andre 3D-systemer, hvilket hindrer en korrekt forståelse af celle adfærd i disse modeller.
Gang har de celler adhæreret på en 2D substrat, excitation af den dorsale receptorer – ved overlejring af en film af et nyt materiale (sandwich-lignende kultur) – kan udløse cellereaktioner ens 3D-miljøer. Den reasøn bag dette er den samtidige aktivering af både dorsale og ventrale receptorer til at klæbe og spredning i sandwich miljø (figur 1) 9,10. Som følge heraf celler undergår væsentlige ændringer i forhold til 2D kulturer 11,12. Således er celle skæbne bestemmes under samling grund af sandwich kultur, da den dorsale stimulation udløser ændringer i vigtige cellulære veje. Derfor er celleskæbnen stærkt bestemt af det tidspunkt, hvor sandwich-lignende kultur samles 11.
På grund af karakteren af systemet, en sandwich-lignende kultur er et enkelt og alsidigt værktøj, der tillader studiet af forskellige parametre i celle / materielle interaktioner, såsom kemi, topografi, stivhed og protein belægninger ved både den ventrale og dorsale sider. Dette giver en højere grad af alsidighed sammenlignet med andre 3D-systemer (figur 2) på grund af den uafhængige dorsale og ventrale kombination af en bred variety af overfladeforhold. Derudover kan forskellige cellelinjer og forskellige tidspunkter til at samle sandwich-lignende kultur undersøges, hvilket øger den brede spektre af muligheder.
En standardprotokol af sandwich-lignende kultur er beskrevet nedenfor under anvendelse af enten poly-L-mælkesyre (PLLA) elektrospundne fibre eller film som dorsale substrater, dækglas som ventrale substrat og fibronectin som protein belægning. Sandwich-lignende kulturer blev samlet lige efter cellepodning eller efter 3 timer af 2D kultur. Bemærk dog, at andre væsentlige systemer og proteiner kunne anvendes; ligeledes sandwich-lignende kultur kan samles på forskellige tidspunkter.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dag, 3D kulturen er et vigtigt emne for den farmaceutiske og bioteknologiske industri samt forskning i cellebiologi, herunder kræft og stamceller. Som følge heraf er der udviklet flere 3D dyrkningssystemer. Desværre, forskelle mellem de 3D-systemer som regel resultere i forskellige celle adfærd, hindrer forståelsen af cellens skæbne. Desuden eksperimentelle procedurer er normalt ikke så ligetil som for 2D dyrkningssystemer. Dermed udvikle nye dyrkningssystemer, der søger at overvinde nogle af disse ulemp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The support from ERC through HealInSynergy (306990) and the FPU program AP2009-3626 are acknowledged.
Materials
| Ploy(lactic acid) | NatureWorks | 4042D | Reagent |
| Cover glasses (12 mmØ) | Marienfeld | 631-0666 | Equipment |
| Chloroform | Scharlab | CL0200 | Reagent |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Sigma | 105228 | Reagent |
| Syringe (1mL) | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | Equipment |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE1000 | Equipment |
| High Voltage DC Power Supply | Glassman High Voltage | Series FC | Equipment |
| Incubator | Hucoa-Herlös | 3111 | Equipment |
| Laminar flow hood | Telstar | AV30/70 | Equipment |
| Human Fibronectin | Sigma | F2006 | Reagent |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Inverted microscope | Leica Microsystems | DMI 6000 | Equipment |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Reagent |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A7409 | Reagent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Reagent |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. 125 (Pt 13), 3015-3024 (2012).
- Weiss, P. . Rev. Mod. Phys. 31 (1), 11-20 (1959).
- Ruffner, H., Lichtenberg, J. 3D cell culture systems–towards primary drug discovery platforms: an interview with Heinz Ruffner (Novartis) and Jan Lichtenberg (InSphero). Biotechnol J. 7 (7), 833-834 (2012).
- Horning, J. L., et al. 3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs. Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).
- Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160 (2), 267-277 (2003).
- Schor, S. L., et al. A novel ‘sandwich’ assay for quantifying chemo-regulated cell migration within 3-dimensional matrices: wound healing cytokines exhibit distinct motogenic activities compared to the transmembrane assay. Cell Motil Cytoskeleton. 63 (5), 287-300 (2006).
- Lee, E. J., Hwang, C. M., Baek, D. H., Lee, S. H. Fabrication of microfluidic system for the assessment of cell migration on 3D micropatterned substrates. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009 (2009), 6034-6037 (2009).
- Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 10889-10894 (2006).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in sandwich-like microenvironments. Effect on cell differentiation. Biotechnol Bioeng. 110 (11), 3048-3058 (2013).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Moratal, D., Salmerón-Sánchez, M. Fibronectin-matrix sandwich-like microenvironments to manipulate cell fate. Biomater. Sci. 2 (3), 381-389 (2014).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in cell-material interactions: effect on cell morphology. Biointerphases. 7 (1-4), 39 (2012).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Cell migration within confined sandwich-like nanoenvironments. Nanomedicine. , (2015).
- Glaß, M., et al. Cell Migration Analysis: Segmenting Scratch Assay Images with Level Sets and Support Vector Machines. Pattern Recogn. 45 (9), 3154-3165 (2012).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Huebsch, N., Arany, P. R., Mao, A. S., et al. Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate. Nat. Mater. 9 (6), 518-526 (2010).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Stimulatory effects of a three-dimensional microenvironment on cell-mediated fibronectin fibrillogenesis. J Cell Sci. 118 (Pt 19), 4427-4436 (2005).
