Microambienti sandwich di sfruttare Cellulari / Materiale Interazioni
Summary
The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.
Abstract
Colture cellulari è stata tradizionalmente effettuata su substrati bi-dimensionali (2D) in cui le cellule aderiscono con recettori ventrali alla superficie biomateriale. Tuttavia in vivo, la maggior parte delle cellule sono completamente circondati dalla matrice extracellulare (ECM), risultando in un tridimensionale (3D) distribuzione dei recettori. Questo può innescare differenze nella outside-in vie di segnalazione e quindi nel comportamento delle cellule.
Questo articolo dimostra che la stimolazione dei recettori dorsali di cellule già aderito ad un substrato 2D sovrapponendo una pellicola di un nuovo materiale (una coltura a sandwich) innesca modifiche importanti rispetto a culture 2D standard. Inoltre, l'eccitazione contemporanea dei recettori ventrale e dorsale sposta comportamento delle cellule più vicina a quella che si trova in ambienti 3D. Inoltre, a causa della natura del sistema, una cultura sandwich è uno strumento versatile che permette lo studio di diversi parametri di cella / materiale interactions, ad esempio, la topografia, la rigidità e diversi rivestimenti di proteine su entrambi i lati ventrale e dorsale. Infine, dal momento che le culture sandwich si basano su substrati 2D, diverse procedure di analisi già sviluppati per le culture 2D standard, può essere utilizzato normalmente, superando le procedure più complesse necessarie per i sistemi 3D.
Introduction
Tradizionalmente, coltura cellulare è stata effettuata su (2D) substrati bi-dimensionali, anche se la maggior parte dei microambienti cellulari in vivo hanno un (3D) natura tridimensionale. Questo ambiente 2D innaturale provoca cambiamenti nel comportamento delle cellule, come un modo di auto-adattamento ad un mondo piatto, che influenza direttamente il destino della cellula 1,2. Pertanto, i risultati ottenuti su colture cellulari 2D non sono sempre riproducibili in vivo. Ciò ha favorito lo sviluppo di nuovi sistemi di coltura interessati cercano di fornire condizioni più fisiologiche simili per ottenere ulteriori approfondimenti qualsiasi meccanismo biologico 3,4 dimensione-dipendente.
Una delle principali differenze tra la cultura 2D e 3D in ambiente vivo è la distribuzione dei recettori cellulari ancorate alla matrice extracellulare (ECM): considerando che il 2D substrati cellule aderiscono ventralmente, la maggior parte delle cellule in vivo sono completamente circondato dal ECM e quindi cell adesione avviene attraverso una distribuzione 3D dei recettori. Questo innesca diverse vie di segnalazione di adesione delle cellule che modulano in tal modo i processi importanti, come la crescita cellulare, la differenziazione cellulare e l'espressione genica. Nel corso degli ultimi decenni, molti diversi sistemi di coltura 3D sono stati stabiliti 5-8, anche se la loro variabilità e complessità ostacolano la loro standardizzazione delle procedure di coltura delle cellule comune. Inoltre sistemi 3D di solito non sono facili da gestire e le attuali procedure sperimentali su supporti 2D non possono essere facilmente stabiliti per le culture 3D. Inoltre, la letteratura a confronto raramente culture 3D con la condizione 2D equivalente o altri sistemi 3D, ostacolando la corretta comprensione del comportamento delle cellule in questi modelli.
Una volta che le cellule aventi aderito su un substrato 2D, l'eccitazione dei recettori dorsali – sovrapponendo una pellicola di un nuovo materiale (coltura a sandwich) – può innescare risposte cellulari simili ambienti 3D. La reafiglio di questo è l'attivazione simultanea di entrambi dorsale e ventrale recettori di aderire e diffondere all'interno dell'ambiente panino (Figura 1) 9,10. Di conseguenza, le cellule subiscono cambiamenti rilevanti rispetto alle colture 2D 11,12. Così, il destino della cellula è determinata durante il montaggio a causa della cultura panino, poiché la stimolazione dorsale provoca variazioni percorsi cellulari chiave. Pertanto, il destino cellulare è fortemente determinato dal tempo in cui la coltura a sandwich è assemblato 11.
A causa della natura del sistema, una cultura sandwich è uno strumento semplice e versatile che consente lo studio dei parametri differenti nelle interazioni cellula / materiale come rivestimenti chimica, topografia, rigidità e proteine ad entrambi i lati ventrale e dorsale. Ciò offre un maggior grado di flessibilità rispetto ad altri sistemi 3D (Figura 2) a causa dorsale indipendente e combinazione ventrale un'ampia variety delle condizioni della superficie. Inoltre, diverse linee cellulari e tempi diversi per assemblare la coltura a sandwich possono essere studiati, aumentando l'ampio spettro di possibilità.
Un protocollo standard della cultura sandwich è di seguito utilizzando poli-L-lattico (PLLA) fibre elettrofilate o film come substrati dorsali, vetrino di vetro come substrato ventrale e fibronectina come rivestimento proteico. Culture sandwich sono stati assemblati subito dopo la semina delle cellule o dopo 3 ore di coltura 2D. Si noti tuttavia che potrebbero essere utilizzati altri sistemi di materiali e proteine; analogamente la cultura sandwich può essere montato a tempi diversi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Al giorno d'oggi, la cultura 3D è un tema importante per l'industria farmaceutica e biotecnologica, nonché la ricerca in biologia cellulare, tra cui il cancro e le cellule staminali. Di conseguenza sono stati sviluppati diversi sistemi di coltura 3D. Purtroppo, le differenze tra i sistemi 3D di solito determinano il comportamento cellulare diverso, ostacolando la comprensione del destino delle cellule. Inoltre, le procedure sperimentali di solito non sono così semplice come per sistemi di coltura 2D. Quindi l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The support from ERC through HealInSynergy (306990) and the FPU program AP2009-3626 are acknowledged.
Materials
| Ploy(lactic acid) | NatureWorks | 4042D | Reagent |
| Cover glasses (12 mmØ) | Marienfeld | 631-0666 | Equipment |
| Chloroform | Scharlab | CL0200 | Reagent |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Sigma | 105228 | Reagent |
| Syringe (1mL) | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | Equipment |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE1000 | Equipment |
| High Voltage DC Power Supply | Glassman High Voltage | Series FC | Equipment |
| Incubator | Hucoa-Herlös | 3111 | Equipment |
| Laminar flow hood | Telstar | AV30/70 | Equipment |
| Human Fibronectin | Sigma | F2006 | Reagent |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Inverted microscope | Leica Microsystems | DMI 6000 | Equipment |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Reagent |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A7409 | Reagent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Reagent |
References
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