Microenvironnements sandwich à exploiter cellulaires / Interactions matérielles

Summary

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Abstract

La culture cellulaire a été traditionnellement effectuée sur bidimensionnel (2D) substrats où les cellules adhèrent utilisant des récepteurs à la surface ventrale biomatériau. Toutefois in vivo, la plupart des cellules sont complètement entourés par la matrice extracellulaire (ECM), ce qui entraîne une tridimensionnel (3D) distribution des récepteurs. Ceci peut déclencher des différences de l'extérieur, dans les voies de signalisation et donc dans le comportement des cellules.

Cet article montre que la stimulation des récepteurs dorsales de cellules déjà adhéré à un substrat 2D en superposant un film d'un nouveau matériau (une culture de sandwich) déclenche des changements importants en ce qui concerne les cultures 2D standard. En outre, l'excitation simultanée des récepteurs ventrales et dorsales décale le comportement des cellules plus proche de celle trouvée dans les environnements 3D. En outre, en raison de la nature du système, une culture en sandwich est un outil polyvalent qui permet l'étude de différents paramètres de cellule / matériau interactions, par exemple, la topographie, la raideur et différents revêtements de protéines à la fois les côtés ventrales et dorsales. Enfin, depuis les cultures sandwich-like sont basés sur des substrats 2D, plusieurs procédures d'analyse déjà développés pour des cultures 2D standard peut être utilisé normalement, surmonter des procédures plus complexes nécessaires pour les systèmes 3D.

Introduction

Traditionnellement, la culture cellulaire a été réalisée sur bidimensionnels (2D) des substrats, si la plupart des micro-environnements cellulaires in vivo ont un (3D) nature tridimensionnelle. Cet environnement 2D contre nature provoque des changements dans le comportement des cellules comme un moyen d'auto-adaptation à un monde plat, ce qui influe directement sur ​​le destin des cellules ^1,2. Par conséquent, les résultats obtenus sur les cultures de cellules 2D ne sont pas toujours reproductible in vivo. Cela a encouragé le développement de nouveaux systèmes de culture pertinentes qui cherchent à offrir des conditions plus physiologiques semblables pour obtenir de nouvelles informations sur un mécanisme biologique de dimension ^{3,4-dépendante.}

L'une des principales différences entre la culture 2D et le 3D dans un environnement in vivo est la distribution des récepteurs de cellules ancrées sur la matrice extracellulaire (ECM): tandis que sur 2D substrats cellules adhèrent ventralement, la majorité des cellules in vivo est complètement entourée par l'ECM et donc CEll adhérence se produit à travers une distribution 3D des récepteurs. Cela déclenche différentes voies de signalisation de l'adhérence cellulaire modulant ainsi les processus importants tels que la croissance cellulaire, la différenciation cellulaire et l'expression des gènes. Durant les dernières décennies, de nombreux systèmes de culture 3D différents ont été établis ^5-8, mais leur variabilité et la complexité entravent leur normalisation dans les procédures de culture cellulaire commune. En outre les systèmes 3D ne sont généralement pas faciles à manipuler et procédures expérimentales actuelles sur des substrats 2D ne peuvent être facilement établis pour les cultures 3D. En outre, la littérature compare rarement cultures 3D avec la condition de 2D équivalent ou des autres systèmes 3D, ce qui entrave la bonne compréhension du comportement des cellules dans ces modèles.

Une fois que les cellules ayant adhéré à un substrat en 2D, l'excitation des récepteurs dorsales – en superposant un film d'un nouveau matériau (culture en sandwich) – peuvent déclencher des réponses des cellules aussi bien des environnements 3D. Le reafils derrière cela est l'activation simultanée de deux récepteurs dorsale et ventrale à adhérer et la propagation dans l'environnement sandwich (Figure 1) ^9,10. En conséquence, les cellules subissent des changements importants en ce qui concerne les cultures 2D ^11,12. Ainsi, le devenir des cellules est déterminée lors de l'assemblage du fait de la culture en sandwich, étant donné que la stimulation dorsale déclenche les changements dans les voies cellulaires clés. Par conséquent, le destin des cellules est fortement déterminée par le moment où la culture en sandwich ¹¹ est assemblé.

En raison de la nature du système, une culture en sandwich est un outil simple et polyvalent qui permet l'étude de différents paramètres dans les interactions cellule / matérielles telles que la chimie, de la topographie, de rigidité et de protéines revêtements à la fois les côtés ventrales et dorsales. Cela offre un degré de polyvalence plus élevé par rapport à d'autres systèmes 3D (figure 2) en raison de la dorsale indépendante et la combinaison ventrale d'un large variété des conditions de surface. En outre, différentes lignées cellulaires et à des moments différents assembler la culture en sandwich peuvent être étudiés, ce qui augmente le large spectre de possibilités.

Un protocole standard de la culture en sandwich est détaillée ci-dessous en utilisant soit de poly-L-lactique (PLLA) des fibres ou des films en tant que substrats électrofilées dorsales, lamelle de verre comme substrat ventral et de la fibronectine comme protéine de revêtement. cultures de sandwich ont été assemblés juste après l'ensemencement des cellules ou après 3 h de culture 2D. Toutefois, notez que d'autres systèmes de matériaux et des protéines pourraient être utilisés; De même, la culture en sandwich peut être assemblé à différents points dans le temps.

Protocol

1. La production de substrats dorsales Production d'un film plat de PLLA par coulée au solvant. Travailler dans une hotte de laboratoire pour préparer une solution de 2% (p / v) dans du chloroforme PLLA (PLLA 2 g dans 100 ml de chloroforme) par agitation à la température ambiante (TA) jusqu'à dissolution complète (environ 3 heures). Placez les rondelles sur une boîte de Pétri en verre. Note: utiliser des rondelles en acier inoxydable avec un diamètre intérieur de 10…

Representative Results

La stimulation des récepteurs dorsales dans la culture en sandwich déclenche des changements dans la morphologie cellulaire, l'adhésion cellulaire et des voies de signalisation intracellulaires (par exemple, l'adhérence focale kinase, FAK) 12/10. A titre d'exemple, des fibroblastes en culture dans le système sandwich surexprimés la sous-unité α de l'intégrine 5 par rapport au 2D, comme on l'observe pour d'autres cultures 3D 15,16. <p class="j…

Discussion

De nos jours, la culture 3D est un sujet important pour l'industrie pharmaceutique et biotechnologique ainsi que la recherche en biologie cellulaire, y compris le cancer et les cellules souches. En conséquence, plusieurs systèmes de culture en 3D ont été développés. Malheureusement, les différences entre les systèmes 3D se traduisent habituellement par le comportement des cellules différentes, ce qui entrave la compréhension du destin cellulaire. En outre, les procédures expérimentales sont généralemen…

Materials

Ploy(lactic acid)	NatureWorks	4042D	Reagent
Cover glasses (12 mmØ)	Marienfeld	631-0666	Equipment
Chloroform	Scharlab	CL0200	Reagent
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)	Sigma	105228	Reagent
Syringe (1mL)	Henke Sass Wolf	4010-200V0	Equipment
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE1000	Equipment
High Voltage DC Power Supply	Glassman High Voltage	Series FC	Equipment
Incubator	Hucoa-Herlös	3111	Equipment
Laminar flow  hood	Telstar	AV30/70	Equipment
Human Fibronectin	Sigma	F2006	Reagent
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	Reagent
Inverted microscope	Leica Microsystems	DMI 6000	Equipment
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Reagent
Albumin	Sigma-Aldrich	A7409	Reagent
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	Reagent