Microentornos-Sandwich como para aprovechar Celulares / Materiales Interacciones
Summary
The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.
Abstract
El cultivo celular se ha llevado a cabo tradicionalmente en sustratos bi-dimensional (2D) donde las células se adhieren utilizando receptores ventral a la superficie del biomaterial. Sin embargo, en vivo, la mayoría de las células están completamente rodeados por la matriz extracelular (ECM), lo que resulta en un (3D) la distribución tridimensional de los receptores. Esto puede provocar diferencias en el exterior, en las vías de señalización y por lo tanto en el comportamiento celular.
Este artículo muestra que la estimulación de los receptores de las células dorsales ya adheridos a un sustrato 2D superponiendo una película de un nuevo material (una cultura de sándwich) provoca cambios importantes con respecto a las culturas 2D estándar. Además, la excitación simultánea de los receptores de ventral y dorsal se desplaza el comportamiento celular más cerca de la que se encuentra en entornos 3D. Además, debido a la naturaleza del sistema, una cultura de sándwich es una herramienta versátil que permite el estudio de diferentes parámetros en células / material de interacciones, por ejemplo, la topografía, la rigidez y diferentes recubrimientos de proteínas en ambos los lados ventral y dorsal. Por último, dado que las culturas-sándwich como se basan en sustratos 2D, varios procedimientos de análisis ya desarrollados por las culturas 2D estándar se puede utilizar normalmente, la superación de los procedimientos más complejos necesarios para sistemas 3D.
Introduction
Tradicionalmente, el cultivo celular se ha llevado a cabo en sustratos bidimensionales (2D), aunque la mayoría de los microambientes celulares in vivo tienen una naturaleza tridimensional (3D). Este entorno 2D antinatural desencadena cambios en el comportamiento celular como una forma de auto-adaptación a un mundo plano, lo que afecta directamente el destino celular 1,2. Por lo tanto, los resultados obtenidos en cultivos de células 2D no siempre son reproducibles in vivo. Esto ha favorecido el desarrollo de nuevos sistemas de cultivo relevantes que buscan ofrecer condiciones más fisiológicas similares a obtener más conocimientos sobre cualquier mecanismo biológico 3,4-dimensión dependiente.
Una de las principales diferencias entre la cultura 2D y 3D en el entorno vivo es la distribución de receptores de las células ancladas a la matriz extracelular (ECM): mientras que en sustratos 2D células se adhieren ventralmente, la mayoría de las células in vivo son completamente rodeado por el ECM y por tanto, cell adhesión se produce a través de una distribución 3D de los receptores. Esto desencadena diferentes vías de señalización que modulan la adhesión celular así los procesos importantes tales como el crecimiento celular, la diferenciación celular y la expresión génica. Durante las últimas décadas, muchos sistemas de cultivo 3D diferentes se han establecido 5-8, aunque su variabilidad y complejidad dificultan su estandarización en los procedimientos de cultivo celular común. Por otra parte los sistemas 3D no suelen ser fáciles de manejar y procedimientos experimentales actuales sobre sustratos 2D no se pueden establecer fácilmente por las culturas 3D. Además, la literatura raramente compara culturas 3D con la condición 2D equivalente u otros sistemas 3D, lo que dificulta la comprensión adecuada de comportamiento celular en estos modelos.
Una vez que tiene las células adheridas sobre un sustrato de 2D, la excitación de los receptores de dorsales – por superposición de una película de un nuevo material (cultivo de sándwich) – pueden desencadenar respuestas de las células por igual entornos 3D. El reahijo detrás de esto es la activación simultánea de ambos dorsal y ventral receptores de adherirse y propagación en el medio ambiente sándwich (Figura 1) 9,10. Como consecuencia, las células sufren cambios importantes con respecto a las culturas 2D 11,12. Por lo tanto, el destino celular se determina durante el montaje debido a la cultura de sándwich, ya que la estimulación dorsal provoca cambios en las vías celulares clave. Por lo tanto, el destino de la célula está altamente determinada por el tiempo cuando la cultura de sándwich se ensambla 11.
Debido a la naturaleza del sistema, una cultura de sándwich es una herramienta sencilla y versátil que permite el estudio de diferentes parámetros en las interacciones célula / materiales tales como revestimientos de química, topografía, rigidez y proteínas en ambos los lados ventral y dorsal. Esto ofrece un mayor grado de versatilidad en comparación con otros sistemas 3D (Figura 2) debido a la dorsal independiente y combinación ventral de una amplia variedad de condiciones de la superficie. Además, diferentes líneas celulares y diferentes momentos para ensamblar la cultura de sándwich pueden ser estudiados, aumentando el ancho espectro de posibilidades.
Un protocolo estándar de la cultura-sándwich como se detalla a continuación utilizando poli-L-láctico (PLLA) electrospun fibras o películas como sustratos dorsales, cubreobjetos de vidrio como sustrato ventral y fibronectina como recubrimiento de proteína. Culturas de sándwich se reunieron poco después de la siembra de células o después de 3 horas de la cultura 2D. Sin embargo, tenga en cuenta que otros sistemas materiales y proteínas podrían utilizarse; Del mismo modo la cultura de sándwich puede ser montado en diferentes puntos temporales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoy en día, la cultura 3D es un tema importante para la industria farmacéutica y biotecnológica, así como la investigación en biología celular, incluyendo el cáncer y células madre. Como consecuencia de ello se han desarrollado varios sistemas de cultivo 3D. Desafortunadamente, las diferencias entre los sistemas 3D suelen dar lugar a un comportamiento celda diferente, lo que dificulta la comprensión del destino celular. Además, los procedimientos experimentales no suelen ser tan sencillo como para los sistemas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The support from ERC through HealInSynergy (306990) and the FPU program AP2009-3626 are acknowledged.
Materials
| Ploy(lactic acid) | NatureWorks | 4042D | Reagent |
| Cover glasses (12 mmØ) | Marienfeld | 631-0666 | Equipment |
| Chloroform | Scharlab | CL0200 | Reagent |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Sigma | 105228 | Reagent |
| Syringe (1mL) | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | Equipment |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE1000 | Equipment |
| High Voltage DC Power Supply | Glassman High Voltage | Series FC | Equipment |
| Incubator | Hucoa-Herlös | 3111 | Equipment |
| Laminar flow hood | Telstar | AV30/70 | Equipment |
| Human Fibronectin | Sigma | F2006 | Reagent |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Inverted microscope | Leica Microsystems | DMI 6000 | Equipment |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Reagent |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A7409 | Reagent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Reagent |
References
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