Sandwich-lignende microenvironments å utnytte Cell / Material Interactions
Summary
The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.
Abstract
Cellekultur har tradisjonelt blitt utført på bi-dimensjonale (2D) substrater hvor cellene fester seg ved hjelp av ventral reseptorer til biomaterialet overflaten. Imidlertid in vivo, de fleste av cellene er fullstendig omgitt av den ekstracellulære matriks (ECM), som resulterer i en tre-dimensjonal (3D) fordeling av reseptorer. Dette kan utløse forskjeller i utsiden-i signalveier og dermed i celle atferd.
Denne artikkelen viser at stimulerende dorsal-reseptorene til celler som allerede er festet til en 2D-substrat ved overlegging av en film av et nytt materiale (en sandwich-lignende kultur) utløser viktige endringer med hensyn til standard 2D-kulturer. Videre er den samtidige magnetisering av ventrale og dorsale reseptorer forskyver celle atferd nærmere den som finnes i 3D-miljøer. I tillegg, på grunn av beskaffenheten av systemet, er en sandwich-lignende kultur en allsidig verktøy som gjør det mulig å studere forskjellige parametre i celle / materiale interactions, for eksempel topografi, stivhet og ulike proteinbelegg på begge ventrale og dorsale sider. Til slutt, siden Sandwich-lignende kulturer er basert på 2D underlag, flere analyseprosedyrer som allerede er utviklet for standard 2D kulturer kan brukes som normalt, vinne mer komplekse prosedyrer som trengs for 3D-systemer.
Introduction
Tradisjonelt har cellekultur blitt utført på bi-dimensjonale (2D) substrater, selv om de fleste av de in vivo cellulære mikromiljøer har en tre-dimensjonal (3D) natur. Dette unaturlig 2D miljø utløser endringer i celle atferd som en måte selv tilpasning til en flat verden, som direkte påvirker celle skjebne 1,2. Derfor resultater oppnådd på 2D-cellekulturer er ikke alltid reproduserbare in vivo. Dette har oppmuntret til utvikling av nye relevante kultursystemer som søker å gi flere fysiologiske lignende forhold for å få ytterligere innsikt i noen dimensjon avhengig biologisk mekanisme 3,4.
En av de viktigste forskjellene mellom 2D og 3D-kultur in vivo miljøet er fordelingen av cellereseptorer forankret til den ekstracellulære matriks (ECM), mens på 2D substrates celler holder seg ventralt, er de fleste av cellene in vivo fullstendig omgitt av ECM og dermed cell vedheft skjer gjennom en 3D-distribusjon av reseptorer. Dette utløser forskjellige celleadhesjon signalbaner som derved modulerer viktige prosesser så som cellevekst, celledifferensiering og genekspresjon. I løpet av de siste tiårene har mange forskjellige 3D kultursystemer er etablert 5-8, selv om deres variasjon og kompleksitet hindre deres standardisering felles cellekultur prosedyrer. Videre 3D-systemer er vanligvis ikke lett å håndtere og dagens eksperimentelle prosedyrer på 2D underlag kan ikke være lett etablert for 3D kulturer. I tillegg, litteratur sjelden sammen 3D kulturer med tilsvarende 2D tilstand eller andre 3D-systemer, hindrer riktig forståelse av celle atferd i disse modellene.
En gang å ha cellene som festet seg på et 2D-substrat, eksitasjon av dorsal reseptorene – ved å legge over en film av et nytt materiale (-sandwich-lignende kultur) – kan føre til celle-responser både 3D-miljøer. Reason bak dette er den samtidige aktivering av både dorsale og ventrale reseptorer for å overholde og spre seg i sandwich-miljø (figur 1) 9,10. Som en konsekvens av dette, gjennomgår celler viktige endringer med hensyn til 2D kulturer 11,12. Således blir celle skjebne bestemmes ved montering på grunn av sandwich-kultur, ettersom den dorsale stimulering utløser endringer i viktige cellulære veier. Derfor blir celle skjebnen høyt bestemt av den tiden da sandwich-lignende kultur er satt sammen 11.
På grunn av beskaffenheten av systemet, er en sandwich-lignende kultur en enkel og allsidig verktøy som gjør det mulig å studere forskjellige parametre i celle / material interaksjoner som kjemi, topografi, stivhet og proteinbelegg på både ventrale og dorsale sider. Dette gir en høyere grad av fleksibilitet i forhold til andre 3D-systemer (figur 2) på grunn av den uavhengige dorsal og ventrale kombinasjon av et bredt variety av overflateforhold. I tillegg kan ulike cellelinjer og forskjellige tider for å montere sandwich-lignende kultur undersøkes, øker det brede spektrum av muligheter.
En standardprotokoll av sandwich-lignende kulturen er beskrevet nedenfor ved anvendelse av enten poly-L-melkesyre (PLLA) elektrospunnede fibre eller filmer som rygg substrater, glass dekkglass som ventral substrat og fibronektin som proteinbelegg. Sandwich-lignende kulturer ble montert like etter celle seeding eller etter tre timer av 2D kultur. Vær imidlertid oppmerksom på at andre vesentlige systemer og proteiner kan brukes; Likeledes sandwich-lignende kultur kan bli satt sammen på forskjellige tidspunkter.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dag er 3D kultur et viktig tema for farmasøytisk og bioteknologisk industri samt forskning innen cellebiologi, inkludert kreft og stamceller. Som en følge av flere 3D-kultursystemer har blitt utviklet. Dessverre er forskjeller mellom 3D-systemer vanligvis resultere i forskjellige celle atferd, hindrer forståelse av cellen skjebne. Dessuten eksperimentelle prosedyrer er vanligvis ikke så enkelt som for 2D kultursystemer. Derav utvikle nye kultursystemer som søker å overvinne noen av disse ulempene er meget viktig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The support from ERC through HealInSynergy (306990) and the FPU program AP2009-3626 are acknowledged.
Materials
| Ploy(lactic acid) | NatureWorks | 4042D | Reagent |
| Cover glasses (12 mmØ) | Marienfeld | 631-0666 | Equipment |
| Chloroform | Scharlab | CL0200 | Reagent |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Sigma | 105228 | Reagent |
| Syringe (1mL) | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | Equipment |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE1000 | Equipment |
| High Voltage DC Power Supply | Glassman High Voltage | Series FC | Equipment |
| Incubator | Hucoa-Herlös | 3111 | Equipment |
| Laminar flow hood | Telstar | AV30/70 | Equipment |
| Human Fibronectin | Sigma | F2006 | Reagent |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Inverted microscope | Leica Microsystems | DMI 6000 | Equipment |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Reagent |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A7409 | Reagent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Reagent |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. 125 (Pt 13), 3015-3024 (2012).
- Weiss, P. . Rev. Mod. Phys. 31 (1), 11-20 (1959).
- Ruffner, H., Lichtenberg, J. 3D cell culture systems–towards primary drug discovery platforms: an interview with Heinz Ruffner (Novartis) and Jan Lichtenberg (InSphero). Biotechnol J. 7 (7), 833-834 (2012).
- Horning, J. L., et al. 3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs. Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).
- Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160 (2), 267-277 (2003).
- Schor, S. L., et al. A novel ‘sandwich’ assay for quantifying chemo-regulated cell migration within 3-dimensional matrices: wound healing cytokines exhibit distinct motogenic activities compared to the transmembrane assay. Cell Motil Cytoskeleton. 63 (5), 287-300 (2006).
- Lee, E. J., Hwang, C. M., Baek, D. H., Lee, S. H. Fabrication of microfluidic system for the assessment of cell migration on 3D micropatterned substrates. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009 (2009), 6034-6037 (2009).
- Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 10889-10894 (2006).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in sandwich-like microenvironments. Effect on cell differentiation. Biotechnol Bioeng. 110 (11), 3048-3058 (2013).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Moratal, D., Salmerón-Sánchez, M. Fibronectin-matrix sandwich-like microenvironments to manipulate cell fate. Biomater. Sci. 2 (3), 381-389 (2014).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in cell-material interactions: effect on cell morphology. Biointerphases. 7 (1-4), 39 (2012).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Cell migration within confined sandwich-like nanoenvironments. Nanomedicine. , (2015).
- Glaß, M., et al. Cell Migration Analysis: Segmenting Scratch Assay Images with Level Sets and Support Vector Machines. Pattern Recogn. 45 (9), 3154-3165 (2012).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Huebsch, N., Arany, P. R., Mao, A. S., et al. Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate. Nat. Mater. 9 (6), 518-526 (2010).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Stimulatory effects of a three-dimensional microenvironment on cell-mediated fibronectin fibrillogenesis. J Cell Sci. 118 (Pt 19), 4427-4436 (2005).
