Analisi miRNA nel tumore alla prostata tessuti cliniche
Summary
Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).
Abstract
Una sfida importante nel cancro della prostata (PCa) gestione clinica è rappresentata dal inadeguatezza di biomarcatori attualmente utilizzati per lo screening delle malattie, la diagnosi, la prognosi e il trattamento. Negli ultimi anni, microRNA (miRNA) sono emersi come biomarcatori alternativi promettenti per la diagnosi del cancro alla prostata e la prognosi. Tuttavia, lo sviluppo di miRNA come biomarcatori efficaci per il cancro alla prostata si basa molto sul loro rilevamento accurato nei tessuti clinici. miRNA analisi nel cancro alla prostata campioni clinici è spesso difficile a causa della eterogeneità del tumore, gli errori di campionamento, contaminazione stromale ecc L'obiettivo di questo articolo è quello di descrivere un flusso di lavoro semplificato per miRNA analizza FFPE archiviati o cancro alla prostata congelato campioni clinici freschi utilizzando una combinazione di quantitativa real-time PCR (RT-PCR) e ibridazione in situ (ISH). All'interno di questo flusso di lavoro, ottimizziamo le metodologie esistenti per l'estrazione miRNA da FFPE e congelato tissu prostataes e espressione analisi da Taqman-sonda basato miRNA RT-PCR. Inoltre, si descrive un metodo ottimizzato per ISH analizza il rilevamento formiRNA in tessuti prostatici con acido nucleico bloccato (LNA) – sonde based. Il nostro protocollo miRNA ISH ottimizzato può essere applicato alle diapositive di cancro alla prostata di tessuto o microarray di tessuti di cancro alla prostata (TMA).
Introduction
Il cancro della prostata è un tumore maligno maschio comunemente diagnosticato che è una delle principali cause di mortalità per cancro correlati tra gli uomini. Negli Stati Uniti, si stima che 220,800 nuovi casi e 27.540 decessi saranno presentate nel 2015 1.
Il cancro della prostata è una malattia eterogenea con malattia molto variabile corso- tumori possono essere indolenti o molto aggressivo. Una sfida importante nel cancro della prostata gestione clinica è rappresentata dal inadeguatezza dei metodi attualmente in uso / biomarcatori per lo screening della malattia, la diagnosi, la prognosi e il trattamento 2. Metodi di screening attuali includono l'antigene prostatico specifico (PSA) e un esame rettale digitale (DRE) seguito da biopsie prostatiche 3. Antigene prostatico specifico (PSA) è il biomarcatore cancro alla prostata più diffuso che ha rivoluzionato in modo significativo la gestione clinica e miglioramento dei tassi di sopravvivenza 4. Tuttavia, a causa dei limiti intrinseci di PSA compreso lack di specificità, screening di PSA-ha causato oltre diagnosi e sopra il trattamento della malattia. In considerazione di ciò, intensi sforzi sono orientati verso la ricerca di alternative biomarcatori del cancro alla prostata, in particolare quelli che possono prevedere l'aggressività della malattia e guidare le decisioni terapeutiche migliori 4,5. Nel corso degli ultimi anni, microRNA (miRNA) sono emersi come promettenti alternative biomarcatori del cancro alla prostata.
I microRNA (miRNA) costituiscono una classe evolutivamente conservata di piccoli RNA non codificanti che sopprimono l'espressione genica livello post-trascrizionale tramite interazioni sequenza-specifiche con le regioni 3'non tradotte (UTR) del target mRNA affini. Si stima che il> 60% di mRNA sono conservate bersagli di miRNA 6. geni miRNA sono localizzati nelle regioni intergeniche o all'interno introni o esoni di proteine / non-codificanti proteine geni 7. Questi geni sono preferenzialmente trascritti dalla RNA polimerasi II in primamiRNA ry (pri-miRNA, lunga diversi kilobasi) che ad anello a forma di gambo strutture secondarie forma a gomito. Questi pri-miRNA vengono trasformati in miRNA precursori (pre-miRNA, lungo 60-75 nucleotidi) che vengono esportati al citoplasma e successivamente trattati in miRNA maturi (lunghi 18-25 nucleotidi) 8-10. miRNA regolano processi cellulari chiave, tra cui la proliferazione, lo sviluppo, la differenziazione e l'apoptosi 11. Gli studi suggeriscono una disregolazione diffuso di profili di espressione dei miRNA in diversi tumori umani tra cui il cancro alla prostata 12-15. Sono stati riportati i profili di espressione di miRNA ad essere ampiamente disregolazione nel cancro della prostata primari e metastatici. MiRNA Altered sono stati collegati con la progressione del cancro alla prostata, l'aggressività e la ricorrenza mettendo in evidenza il potenziale prognostico di miRNA 12,14,16-19. Un crescente corpo di evidenze indicano che i miRNA svolgono ruoli importanti meccanicistici nell'iniziazione cancro alla prostata, lo sviluppo, il progressoioni e metastasi. Nel complesso, miRNA stanno emergendo come biomarcatori alternativi promettenti per la diagnosi del cancro alla prostata e la prognosi in grado di distinguere tra tessuti e gli aiuti normali e tumorali nella stratificazione di tumori della prostata 12. Inoltre, miRNA sono obiettivi importanti per lo sviluppo di terapie efficaci contro il cancro alla prostata 20.
A causa delle loro piccole dimensioni e la resistenza all'attività RNasi endogena, miRNA sono biomarcatori stabili che possono essere facilmente rilevati nei tessuti fissati in formalina 21 e 22 biopsie prostatiche. Inoltre, i profili di espressione di miRNA sono stati confrontati in tessuti congelati e fissati in formalina e sono stati trovati per essere fortemente correlato 21. Tuttavia, miRNA profiling in cancro alla prostata tessuti clinici è spesso difficile a causa della eterogeneità del tumore, gli errori di campionamento, contaminazione stromale ecc Lo sviluppo dei miRNA come biomarcatori efficaci per il cancro alla prostata pesantemente relies sul loro rilevamento accurato nei tessuti clinici. Qui si descrive un flusso di lavoro semplificato utilizzato nel nostro laboratorio per miRNA profilatura in FFPE archiviati o cancro alla prostata congelato campioni clinici freschi. Ci avvaliamo di una combinazione di quantitativa real-time PCR e ibridizzazione in situ per miRNA le analisi di campioni clinici, con l'ex producendo maggiori informazioni quantitative e la seconda per visualizzare l'espressione differenziale delle potenziali biomarcatori miRNA in una vasta gamma di tessuti. All'interno di questo flusso di lavoro, ottimizziamo le metodologie esistenti per l'estrazione miRNA da FFPE e tessuti della prostata congelati, espressione analizza da Taqman-sonda basato miRNA RT-PCR e miRNA in situ tecnica di ibridazione con acido nucleico bloccato (LNA) -based sonde 23. Sonde basato LNA-offrono una maggiore sensibilità e specificità rispetto al DNA o RNA sonde based e consente il rilevamento affidabile di tutte le sequenze di miRNA, indipendentemente dal loro contenuto GC e permettono anche discriminazione delle famiglie miRNA. Il nostro protocollo miRNA ISH ottimizzato può essere applicato alle diapositive di cancro alla prostata di tessuto o microarray di tessuti di cancro alla prostata (TMA), con quest'ultimo che offre il potenziale di accelerare miRNA biomarcatore scoperta.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo articolo, si descrive un flusso di lavoro semplificato per miRNA profilatura in FFPE archiviati o cancro alla prostata congelato tessuti clinici freschi. Nel cancro della prostata, diversi studi suggeriscono un ruolo importante dei microRNA nel cancro alla prostata iniziazione, la progressione e la metastasi. Tuttavia, risultati contrastanti sono spesso ottenuti su uno specifico miRNA 22 in quanto l'estrazione miRNA e analisi metodi differiscono ampiamente. In considerazione degli elementi di pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Roger Erickson per il suo sostegno e assistenza alla preparazione del manoscritto.
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Cancer Institute presso il National Institutes of Health
(Grant Numero RO1CA177984, RO1CA138642), progetto del programma VA sul cancro alla prostata (BX001604).
Materials
| Microtome | Leica Biosystems | RM2255 | |
| Arcturus Autopix for LCM | Arcturus/ Life Technologies | LCM1621/LCM1110 | Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used. |
| CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| miRNeasy FFPE Kit | Qiagen | 217504 | |
| 7500 Fast Real Time PCR System | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4351106 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4366596 | |
| Taqman Fast Universal PCR master mix | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4352042 | |
| DIG labeled LNA probe for U6 | Exiqon | 99002-01 | |
| BM Purple AP substrate | Roche | 11442074001 | |
| Pre-hybridization solution | Biochain | K2191050-1 | |
| Hybridization solution | Biochain | K2191050-2 | |
| Blocking solution | Biochain | K2191050-8 | |
| AP-conjugated anti-digoxigenin antibody | Biochain | K2191050-7 | |
| Aqueous mounting media | Vector Laboratories | H-5501 | |
| Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent) | Life Technologies | 15596-018 | |
| Harris hematoxylin | Statlab | SL200 | |
| Eosin | Statlab | SL201 |
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