Prostat Kanseri Klinik Dokularındaki miRNA İfade Analizleri
Summary
Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).
Abstract
Prostat kanseri (PCa) klinik yönetiminde kritik bir meydan okuma hastalığı taraması, tanısı, prognozu ve tedavisi için günümüzde kullanılan biyolojik belirteçlerin yetersizliği ile ortaya atılır. Son yıllarda, mikroRNAlar (miRNA'lar) prostat kanseri tanı ve prognoz gibi umut verici alternatif biyomarkerları ortaya çıkmıştır. Ancak, prostat kanseri için etkili biyomarkırların olarak miRNA'lar gelişimi ağır klinik dokularda onların doğru algılama dayanır. miRNA genellikle tümör heterojenite, örnekleme hataları, stromal kirlenme vb miRNA bir arada kullanarak arşivlenmiş FFPE veya taze donmuş prostat kanseri, klinik örneklerin analizleri için bu makalenin amacı basitleştirilmiş iş akışı tanımlamaktır nedeniyle zorlu prostat kanseri klinik örneklerin analizleri kantitatif gerçek zamanlı PCR (RT-PCR) ve in situ hibridizasyon (ISH). Bu iş akışı içinde, biz FFPE gelen miRNA çıkarılması için mevcut metodolojiler ve dondurulmuş prostat tissu optimizees ve ifade miRNA RT-PCR tabanlı Taqman-prob ile analiz eder. Dayanan problar – Ayrıca, ISH için optimize edilmiş bir yöntem, kilitli nükleik asit (LNA) kullanılarak prostat dokularında formiRNA algılama analiz tarif eder. Bizim optimize miRNA ISH protokol prostat kanseri dokusu slaytlar veya prostat kanseri dokusu mikrodizileri (TMA) tatbik edilebilir.
Introduction
Prostat bezi kanseri erkekler arasında kanserle ilişkili ölümlerin önde gelen nedenlerinden biri olan yaygın tanı erkek kanseridir. ABD'de, bir 220.800 yeni vaka tahmin ve 27540 ölüm 2015 1 rapor edilecektir.
Prostat kanseri tümörleri tembel ya da çok agresif olabilir ders-derece değişken hastalığı olan heterojen bir hastalıktır. Prostat kanseri, klinik yönetiminde kritik bir meydan okuma hastalığı taraması, tanısı, prognozu ve tedavisi 2 şu anda kullanılan yöntemler / biyomarkerların yetersizliği ile ortaya atılır. Güncel tarama yöntemleri prostat spesifik antijen (PSA) testi ve prostat biyopsisi 3 tarafından izlenen bir parmakla rektal muayene (PRM) içerir. Prostat spesifik antijen (PSA) anlamlı klinik yönetimi ve sağkalım oranları 4 devrim yarattı en yaygın kullanılan prostat kanseri biyomarkerdir. Ancak, PSA dahil lac doğasında sınırlamalarözgünlüğü, PSA bazlı tarama k tanı üzerinde ve hastalığın tedavisi üzerinde yol açmıştır. Bu bakışa göre, yoğun çabalar, alternatif prostat kanseri biyomarkerların için bir arama doğru hastalığın saldırganlık tahmin ve daha iyi tedavi kararları 4,5 sürebilirsin hangi özellikle yöneltiliyor. Son birkaç yıldır, mikroRNAlar (miRNA'lar) umut verici alternatif prostat kanseri biyomarkerler olarak ortaya çıkmıştır.
MikroRNA'lar (miRNA'ların) aynı kökenli mRNA hedef 3'- çevrilmemiş bölgelerin (UTRs) ile sekansa özel etkileşimler yoluyla post-transkripsiyonel gen ekspresyonunu bastırmak küçük kodlayıcı olmayan RNA'lar evrimsel olarak muhafaza edilmiş sınıfını teşkil ederler. Bu mRNA% 60 miRNA'ların 6 hedeflerini muhafaza edilir> olduğu tahmin edilmektedir. miRNA genlerinin intergenik bölgelerde veya intronlar veya genleri 7 kodlama protein / non-protein ekson içinde yer almaktadır. Bu genler tercihen prima içine RNA Polimeraz II transkripsiyonury miRNA'lar (pri-miRNA'lar, birkaç kilobaz uzunluğunda) Bu biçim firkete şeklinde kök halka ikincil yapılar. Bu pri-miRNA'lar sitoplazmaya ihraç ve ayrıca 8-10 (18-25 nükleotid uzunluğunda) olgun miRNA'lar içine işlenir haberci miRNA'lar (60-75 nükleotid uzunluğunda öncesi miRNA'lar) içine işlenir. miRNA'lar çoğalması, geliştirme, farklılaştırma ve apoptoz 11 gibi önemli hücresel süreçleri düzenler. Çalışmalar prostat kanseri 12-15 olmak üzere çeşitli insan malignlerinde miRNA ifade profillerinin yaygın düzensizliği öneririz. MiRNA sentezleme profilleri yaygın primer ve metastatik prostat kanserinde düzensiz için rapor edilmiştir. Altered miRNA ifade miRNA'ların 12,14,16-19 prognostik potansiyelini vurgulayarak prostat kanseri ilerlemesi, saldırganlık ve nüks ile bağlantılı olmuştur. Artan miktarda kanıt vücut miRNA'lar prostat kanseri başlangıcı, gelişimi, ilerleme önemli mekanik rol oynarlar olduğunu gösteririyonu ve metastazı. Genel olarak, miRNA'lar prostat tümörlerinin 12 tabakalaşma normal ve kanserli dokuların ve yardım ayırt edebilirsiniz prostat kanseri tanı ve prognoz gibi umut verici alternatif biyobelirteçleri ortaya çıkmaktadır. Ayrıca, miRNA'ların prostat kanseri 20 karşı etkili terapötik maddelerin geliştirilmesi için önemli hedeflerdir.
Endojen RNaz etkinliğinin kendi küçük boyutu ve direnci nedeniyle, hali hazırda miRNA'ların formalinle sabitlenmiş dokular 21 ve prostat biyopsisi 22 tespit edilebilir stabil biyolojik belirteçler. Ayrıca, miRNA'ların ekspresyon profilleri, sabit dondurulmuş ve formalin dokularda karşılaştırılmış ve güçlü bir biçimde 21 korelasyon olduğu tespit edilmiştir. Ancak, prostat kanseri, klinik dokularda profilleme miRNA ifade genellikle vb prostat kanseri ağır dinleri etkili biyomarkırların olarak miRNA'lar gelişmesi tümör heterojenliği, örnekleme hataları, stromal kirlenme nedeniyle zorluKlinik dokularda onların doğru algılama es. Burada arşivlenmiş FFPE veya taze donmuş prostat kanseri, klinik örneklerde profilleme miRNA ifade laboratuarımızda kullanılan basitleştirilmiş iş akışını açıklar. Biz kantitatif gerçek zamanlı PCR bir arada istihdam ve miRNA için in situ hibridizasyon eski verimli daha nicel bilgi ve dokuların bir dizi potansiyel miRNA biyomarkerlerin diferansiyel ifadesi görselleştirmek için ikincisi ile, klinik örneklerin analizleri. Bu iş akışı içinde, FFPE ve dondurulmuş prostat dokulardan MiRNA çıkarılması için mevcut olan yöntemleri optimize ekspresyon problar 23 tabanlı kilitli nükleik asit (LNA) kullanılarak MiRNA RT-PCR ve miRNA in situ hibridizasyon tekniği göre Taqman probu ile incelenmiştir. LNA tabanlı sondalar DNA- ya da RNA bazlı prob ile karşılaştırıldığında artan duyarlılık ve özgüllük sunmak ve onların GC içeriği ne olursa olsun, tüm miRNA dizilerinin sağlam algılama sağlar ve aynı zamanda ayrımcılığın izinmiRNA ailelerin yon. Bizim optimize miRNA ISH protokol miRNA biyomarker keşfini hızlandırmak için potansiyeli sunan ikincisi ile, prostat kanseri dokusu slaytlar veya prostat kanseri dokusu mikrodizileri (TMA) tatbik edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, arşivlenmiş FFPE veya taze donmuş prostat kanseri, klinik dokularda profilleme miRNA ifade basitleştirilmiş iş akışını açıklar. Prostat kanserinde, çeşitli çalışmalar prostat kanseri başlatılması, ilerlemesinde ve metastazında microRNA önemli bir rol oynadığını düşündürmektedir. Ancak, çelişkili sonuçlar genellikle miRNA çıkarma beri belirli bir miRNA 22 üzerinde elde edilen ve yöntemler çok farklıdır analizlerin. Prostat kanseri prognoz, teşhis ve tedavi i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz yazının hazırlanması ile yaptığı destek ve yardım için Dr. Roger Erickson teşekkür ederim.
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenen
(Hibe Numarası RO1CA177984, RO1CA138642), prostat kanseri (BX001604) VA programı projesi.
Materials
| Microtome | Leica Biosystems | RM2255 | |
| Arcturus Autopix for LCM | Arcturus/ Life Technologies | LCM1621/LCM1110 | Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used. |
| CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| miRNeasy FFPE Kit | Qiagen | 217504 | |
| 7500 Fast Real Time PCR System | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4351106 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4366596 | |
| Taqman Fast Universal PCR master mix | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4352042 | |
| DIG labeled LNA probe for U6 | Exiqon | 99002-01 | |
| BM Purple AP substrate | Roche | 11442074001 | |
| Pre-hybridization solution | Biochain | K2191050-1 | |
| Hybridization solution | Biochain | K2191050-2 | |
| Blocking solution | Biochain | K2191050-8 | |
| AP-conjugated anti-digoxigenin antibody | Biochain | K2191050-7 | |
| Aqueous mounting media | Vector Laboratories | H-5501 | |
| Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent) | Life Technologies | 15596-018 | |
| Harris hematoxylin | Statlab | SL200 | |
| Eosin | Statlab | SL201 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Shen, M. M., Abate-Shen, C. Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges. Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).
- Sequeiros, T., et al. Molecular markers for prostate cancer in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Biomed Res Int. 2013, 283635 (2013).
- Cary, K. C., Cooperberg, M. R. Biomarkers in prostate cancer surveillance and screening: past, present, and future. Ther Adv Urol. 5 (6), 318-329 (2013).
- Sartori, D. A., Chan, D. W. Biomarkers in prostate cancer: what’s new. Curr Opin Oncol. 26 (3), 259-264 (2014).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
- Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome Res. 14 (10A), 1902-1910 (2004).
- Borchert, G. M., Lanier, W., Davidson, B. L. RNA polymerase III transcribes human microRNAs. Nat Struct Mol Biol. 13 (12), 1097-1101 (2006).
- Cai, X., Hagedorn, C. H., Cullen, B. R. Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs. RNA. 10 (12), 1957-1966 (2004).
- Lee, Y., et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J. 23 (20), 4051-4060 (2004).
- Bartel, D. P., et al. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Seth, A. MicroRNAs in prostate cancer: from biomarkers to molecularly-based therapeutics. Prostate Cancer Prostatic Dis. 15 (4), 314-319 (2012).
- Hurst, D. R., Edmonds, M. D., Welch, D. R. Metastamir: the field of metastasis-regulatory microRNA is spreading. Cancer Res. 69 (19), 7495-7498 (2009).
- Saini, S., Majid, S., Dahiya, R. Diet, microRNAs and prostate cancer. Pharm Res. 27 (6), 1014-1026 (2010).
- Saini, S., et al. Regulatory Role of mir-203 in Prostate Cancer Progression and Metastasis. Clin Cancer Res. 17 (16), 5287-5298 (2011).
- Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68 (15), 6162-6170 (2008).
- Martens-Uzunova, E. S., et al. Diagnostic and prognostic signatures from the small non-coding RNA transcriptome in prostate cancer. Oncogene. 31 (8), 978-991 (2012).
- Porkka, K. P., et al. MicroRNA expression profiling in prostate cancer. Cancer Res. 67 (13), 6130-6135 (2007).
- Schaefer, A., et al. Diagnostic and prognostic implications of microRNA profiling in prostate carcinoma. Int J Cancer. 126 (5), 1166-1176 (2010).
- Maugeri-Sacca, M., Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. Functional role of microRNAs in prostate cancer and therapeutic opportunities. Crit Rev Oncog. 18 (4), 303-315 (2013).
- Xi, Y., et al. Systematic analysis of microRNA expression of RNA extracted from fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples. RNA. 13 (10), 1668-1674 (2007).
- Lucas, S. M., Heath, E. I. Current challenges in development of differentially expressed and prognostic prostate cancer biomarkers. Prostate Cancer. , 640968 (2012).
- Singh, S. K., Kumar, R., Wengel, J. Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2′-Amino- and 2′-Thio-LNA Monomeric Nucleosides. J Org Chem. 63 (18), 6078-6079 (1998).
- Suh, S. O., et al. MicroRNA-145 is regulated by DNA methylation and p53 gene mutation in prostate cancer. Carcinogenesis. 32 (5), 772-778 (2011).
- Shukla, C. J., Pennington, C. J., Riddick, A. C., Sethia, K. K., Ball, R. Y., Edwards, D. R. Laser-capture microdissection in prostate cancer research: establishment and validation of a powerful tool for the assessment of tumour-stroma interactions. BJU Int. 101 (6), 765-774 (2008).
- Nelson, P. T., et al. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
- Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), e179 (2005).
- Hanna, J. A., et al. Quantitative analysis of microRNAs in tissue microarrays by in situ hybridization. Biotechniques. 52 (4), 235-245 (2012).
