микроРНК экспрессии анализ рака предстательной железы Клинические тканей
Summary
Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).
Abstract
Важнейшей задачей в рака простаты (РПЖ) клинического управления ставится в неадекватности используемых в настоящее время биомаркеров для скрининга заболевания, диагнозе, прогнозе и лечении. В последние годы, микроРНК (миРНК) появились как перспективные альтернативные биомаркеры для диагностики рака предстательной железы и прогноза. Тем не менее, развитие микроРНК в качестве эффективных биомаркеров рака предстательной железы в значительной степени зависит от их точного обнаружения в клинических тканей. микроРНК анализирует рака простаты клинических образцов часто вызов в связи с неоднородностью опухоли, ошибки выборки, загрязнения и т.п. стромы Цель этой статьи заключается в описании упрощенную рабочий процесс микроРНК анализы в заархивированном FFPE или свежезамороженной рака простаты клинических образцов с использованием комбинации Количественный ПЦР в реальном времени (RT-PCR) и гибридизация (ISH). В этом рабочем процессе, мы оптимизируем существующие методологии для извлечения микроРНК из FFPE и замороженные Tissu простатыES и выражение анализирует по Taqman-зонда на основе микроРНК-ПЦР. Кроме того, мы опишем оптимизированный метод ISH анализа обнаружения formiRNA в тканях предстательной железы с использованием заблокированного нуклеиновой кислоты (LNA) – зонды, основанные. Оптимизированное протокол микроРНК ISH могут быть применены к слайдам рака простаты ткани или ткани предстательной железы микрочипов (TMA).
Introduction
Рак предстательной железы является обычно диагноз мужского злокачественности, что является одним из ведущих причин рака, связанных с смертности среди мужчин. В США, по оценкам, 220,800 новых случаев и смертей 27,540 будут представлены в 2015 году 1.
Рак предстательной железы является гетерогенным заболеванием с высокой переменной болезни курс- опухоли могут быть ленивыми или очень агрессивны. Важнейшей задачей в рака простаты клинического управления ставится в неадекватности используемых в настоящее время методов / биомаркеров для скрининга заболеваний, диагностики, прогноза и лечения 2. Современные методы скрининга включают специфический антиген простаты (ПСА) и пальцевое ректальное исследование (DRE), а затем биопсии предстательной железы 3. Специфического антигена простаты (PSA) является наиболее широко используется рак простаты биомаркеров, что значительно революцию клиническое управление и улучшенные показатели выживания 4. Тем не менее, из-за ограничений, присущих PSA в том числе лакК специфичности, PSA-скрининг привел к более диагноза и в течение лечения заболевания. В связи с этим, интенсивные усилия направлены в сторону поиска альтернативных биомаркеров рака простаты, особенно тех, которые могут предсказать агрессивность заболевания и привод лучшие решения лечения 4,5. За последние несколько лет, микроРНК (миРНК) стали перспективных альтернативных биомаркеров рака простаты.
Микро (микроРНК) составляют эволюционно консервативный класс мелких некодирующих РНК, которые подавляют экспрессию генов посттранскрипционно помощью последовательности конкретных взаимодействий с 3'- нетранслируемые области (НТО) родственных целей мРНК. Считается, что> 60% мРНК сохраняются целей микроРНК 6. микроРНК гены расположены в межгенных или в интронов или экзонов белка / не кодирующих белок генов 7. Эти гены преимущественно расшифрованы РНК-полимеразы II в примыRy микроРНК (PRI-микроРНК, длиной в несколько тысяч пар нуклеотидов), которые образуют шпильки в форме стволовых петля вторичные структуры. Эти PRI-микроРНК обрабатываются в микроРНК-предшественников (пре-микроРНК, 60-75 нуклеотидов в длину), которые экспортируются в цитоплазму и далее перерабатывается в зрелых микроРНК (18-25 нуклеотидов в длину) 8-10. микроРНК регулируют ключевые клеточных процессов, включая пролиферацию, развития, дифференциации и апоптоза 11. Исследования показывают, широкое нарушение регуляции экспрессии микроРНК профилей в различных злокачественных опухолей человека, включая рак простаты 12-15. профили экспрессии микроРНК, как сообщается, широко Нарушение регуляции в сфере начального и метастатическим раком предстательной железы. Измененные выражение микроРНК были связаны с прогрессированием рака простаты, агрессивности и рецидива подсветкой прогностическое потенциал микроРНК 12,14,16-19. Растущее количество доказательств указывает, что микроРНК играют важную роль в механистических рак простаты инициации, развития, прогрессаионов и метастазы. В целом, микроРНК становится перспективные альтернативные биомаркеры для диагностики рака предстательной железы и прогноз, что может отличить нормальных и раковых тканях и помощи в стратификации опухолей простаты 12. Кроме того, микроРНК являются важными мишенями для разработки эффективных терапевтических против рака простаты 20.
Вследствие их маленького размера и устойчивости к эндогенным РНКазы активности, микроРНК являются стабильными биомаркеров, которые могут быть легко обнаружены в фиксированных формалином тканей 21 и 22 в биопсии простаты. Кроме того, профили экспрессии микроРНК были сравнены в замороженных и фиксированных формалином тканей и было обнаружено, что сильно коррелирует 21. Тем не менее, микроРНК выражение профилирования в рака простаты клинических тканей часто вызов в связи с неоднородностью опухоли, ошибки выборки, загрязнения стромы т.д. развития микроРНК в качестве эффективных биомаркеров рака предстательной железы в значительной степени RELIES на их точного обнаружения в клинических тканей. Здесь мы опишем упрощенный рабочий процесс, используемый в нашей лаборатории для микроРНК выражения профилирования в заархивированном FFPE или свежезамороженной рака простаты клинических образцов. Мы используем комбинацию количественного ПЦР в реальном времени и в гибридизация для микроРНК анализа клинических образцов, с бывшим уступая более количественной информации и последний для визуализации дифференциальное выражение потенциальных биомаркеров микроРНК в массиве тканей. В этом рабочем процессе, мы оптимизируем существующие методологии для извлечения микроРНК из FFPE и замороженных тканях простаты, выражение анализирует по Taqman-зонда на основе микроРНК-ПЦР и микроРНК в технике гибридизации месте с помощью заблокированного нуклеиновой кислоты (LNA) основе датчиков 23. LNA-зондов на основе предложить повышенную чувствительность и специфичность по сравнению с ДНК-РНК-зондов или основанных и позволяет надежную обнаружения всех последовательностей микроРНК, независимо от их содержания GC, а также позволит discriminaние микроРНК семей. Оптимизированное протокол микроРНК ISH могут быть применены к слайдам рака простаты ткани или ткани предстательной железы микрочипов (TMA), причем последний обладает потенциалом для ускорения поиска биомаркеров микроРНК.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы опишем упрощенный рабочий процесс для выражения микроРНК профилирования заархивированные FFPE или свежезамороженной рака простаты клинических тканей. При раке предстательной железы, некоторые исследования свидетельствуют о важной роли микроРНК в инициации рака прос?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р Роджер Эриксон за поддержку и помощь в подготовке рукописи.
Эта работа была поддержана Национальным институтом рака при Национальном институте здравоохранения
(Грант Количество RO1CA177984; RO1CA138642), В. А. проект программы на рак предстательной железы (BX001604).
Materials
| Microtome | Leica Biosystems | RM2255 | |
| Arcturus Autopix for LCM | Arcturus/ Life Technologies | LCM1621/LCM1110 | Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used. |
| CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| miRNeasy FFPE Kit | Qiagen | 217504 | |
| 7500 Fast Real Time PCR System | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4351106 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4366596 | |
| Taqman Fast Universal PCR master mix | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4352042 | |
| DIG labeled LNA probe for U6 | Exiqon | 99002-01 | |
| BM Purple AP substrate | Roche | 11442074001 | |
| Pre-hybridization solution | Biochain | K2191050-1 | |
| Hybridization solution | Biochain | K2191050-2 | |
| Blocking solution | Biochain | K2191050-8 | |
| AP-conjugated anti-digoxigenin antibody | Biochain | K2191050-7 | |
| Aqueous mounting media | Vector Laboratories | H-5501 | |
| Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent) | Life Technologies | 15596-018 | |
| Harris hematoxylin | Statlab | SL200 | |
| Eosin | Statlab | SL201 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Shen, M. M., Abate-Shen, C. Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges. Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).
- Sequeiros, T., et al. Molecular markers for prostate cancer in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Biomed Res Int. 2013, 283635 (2013).
- Cary, K. C., Cooperberg, M. R. Biomarkers in prostate cancer surveillance and screening: past, present, and future. Ther Adv Urol. 5 (6), 318-329 (2013).
- Sartori, D. A., Chan, D. W. Biomarkers in prostate cancer: what’s new. Curr Opin Oncol. 26 (3), 259-264 (2014).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
- Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome Res. 14 (10A), 1902-1910 (2004).
- Borchert, G. M., Lanier, W., Davidson, B. L. RNA polymerase III transcribes human microRNAs. Nat Struct Mol Biol. 13 (12), 1097-1101 (2006).
- Cai, X., Hagedorn, C. H., Cullen, B. R. Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs. RNA. 10 (12), 1957-1966 (2004).
- Lee, Y., et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J. 23 (20), 4051-4060 (2004).
- Bartel, D. P., et al. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Seth, A. MicroRNAs in prostate cancer: from biomarkers to molecularly-based therapeutics. Prostate Cancer Prostatic Dis. 15 (4), 314-319 (2012).
- Hurst, D. R., Edmonds, M. D., Welch, D. R. Metastamir: the field of metastasis-regulatory microRNA is spreading. Cancer Res. 69 (19), 7495-7498 (2009).
- Saini, S., Majid, S., Dahiya, R. Diet, microRNAs and prostate cancer. Pharm Res. 27 (6), 1014-1026 (2010).
- Saini, S., et al. Regulatory Role of mir-203 in Prostate Cancer Progression and Metastasis. Clin Cancer Res. 17 (16), 5287-5298 (2011).
- Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68 (15), 6162-6170 (2008).
- Martens-Uzunova, E. S., et al. Diagnostic and prognostic signatures from the small non-coding RNA transcriptome in prostate cancer. Oncogene. 31 (8), 978-991 (2012).
- Porkka, K. P., et al. MicroRNA expression profiling in prostate cancer. Cancer Res. 67 (13), 6130-6135 (2007).
- Schaefer, A., et al. Diagnostic and prognostic implications of microRNA profiling in prostate carcinoma. Int J Cancer. 126 (5), 1166-1176 (2010).
- Maugeri-Sacca, M., Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. Functional role of microRNAs in prostate cancer and therapeutic opportunities. Crit Rev Oncog. 18 (4), 303-315 (2013).
- Xi, Y., et al. Systematic analysis of microRNA expression of RNA extracted from fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples. RNA. 13 (10), 1668-1674 (2007).
- Lucas, S. M., Heath, E. I. Current challenges in development of differentially expressed and prognostic prostate cancer biomarkers. Prostate Cancer. , 640968 (2012).
- Singh, S. K., Kumar, R., Wengel, J. Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2′-Amino- and 2′-Thio-LNA Monomeric Nucleosides. J Org Chem. 63 (18), 6078-6079 (1998).
- Suh, S. O., et al. MicroRNA-145 is regulated by DNA methylation and p53 gene mutation in prostate cancer. Carcinogenesis. 32 (5), 772-778 (2011).
- Shukla, C. J., Pennington, C. J., Riddick, A. C., Sethia, K. K., Ball, R. Y., Edwards, D. R. Laser-capture microdissection in prostate cancer research: establishment and validation of a powerful tool for the assessment of tumour-stroma interactions. BJU Int. 101 (6), 765-774 (2008).
- Nelson, P. T., et al. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
- Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), e179 (2005).
- Hanna, J. A., et al. Quantitative analysis of microRNAs in tissue microarrays by in situ hybridization. Biotechniques. 52 (4), 235-245 (2012).
