تنقية ماوس سفن الدماغ
Summary
We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain’s vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.
Abstract
في الدماغ، أكثر من نظام الأوعية الدموية تتكون من حاجز انتقائي، حاجز الدم في الدماغ (BBB) الذي ينظم تبادل الجزيئات والخلايا المناعية بين الدماغ والدم. وعلاوة على ذلك، يتطلب الطلب الهائل التمثيل الغذائي الخلايا العصبية لائحة لحظة إلى لحظة تدفق الدم. والجدير بالذكر أن شذوذ هذه الأنظمة هي السمات المميزة المسببة لمعظم أمراض الدماغ. بما في ذلك الإصابة بالورم الأرومي الدبقي، والسكتة الدماغية، وذمة، والصرع، والأمراض التنكسية (مثلا: مرض باركنسون ومرض الزهايمر)، وأورام الدماغ، وكذلك حالات الالتهابات مثل التصلب المتعدد، والتهاب السحايا والدماغ الخلل الناجم عن الإنتان. وبالتالي، فهم الأحداث يشير إلى تحوير علم وظائف الأعضاء الدماغية يمثل تحديا كبيرا. الكثير من التبصر في خصائص الخلوية والجزيئية من مختلف أنواع الخلايا التي يتكون منها نظام الدماغية يمكن الحصول عليها من الثقافة الأساسية أو الخلية الفرز من أنسجة المخ فصلها حديثا. ومع ذلك،لا يتم الاحتفاظ بخصائص مثل الخلية القطبية، مورفولوجيا والعلاقات بين الخلايا في هذه الاستعدادات. تم تصميم البروتوكول الذي وصفنا هنا لتنقية شظايا سفينة الدماغ، مع الحفاظ على السلامة الهيكلية. وتبين لنا أن السفن معزولة تتكون من الخلايا البطانية مختومة من قبل منعطفات ضيقة التي تحيط بها الصفيحة القاعدية مستمرة. Pericytes، خلايا العضلات الملساء وكذلك الأغشية المحيطة بالأوعية نجمية endfeet لا تزال تعلق على طبقة الخلايا البطانية. وأخيرا، نحن تصف كيفية إجراء التجارب المناعية على السفن الدماغ تنقيته.
Introduction
يتطلب الأداء السليم للنظام العصبي المركزي (CNS) بيئة خارج الخلية درجة عالية من التنظيم، ومطالبها التمثيل الغذائي ضخمة مقارنة مع الأجهزة الأخرى 1. الجهاز العصبي المركزي هي أيضا حساسة للغاية لمجموعة واسعة من المواد الكيميائية، وغير مؤذية عادة إلى الأجهزة الطرفية ولكن إلى ذلك، أعصاب. لضمان الأداء السليم، أكثر من "CNS الأوعية الدموية تشكل عائقا البطانية. حاجز الدم في الدماغ (BBB) التي تسيطر على تدفق الجزيئات والأيونات وكذلك مرور الخلايا المناعية بين الدم والدماغ، وبالتالي المحافظة على التوازن السليم 2، ولكن أيضا تحد من دخول الأدوية العلاجية، والعلاج مما يعوق الاضطرابات العصبية 3. على المستوى الخلوي، وحافظ على BBB أساسا من منعطفات ضيقة واسعة بين الخلايا البطانية والتعبير استقطابا للنقل هروب رأس المال ومعدل transcytosis منخفضة جدا (4). خصائص ووظائف BBB وبفعل معظمهم من شمال شرقخلايا ighboring 4. على وجه الخصوص، pericytes تلعب دورا هاما في تحريض والحفاظ على BBB 5،6. كونها خلايا مقلص، pericytes أيضا تنظيم تدفق الدم 7 كما تفعل خلايا العضلات الملساء المحيطة السفن الكبيرة. وأخيرا، النجمية، فإن الخلايا الدبقية الرئيسية في الدماغ، وترسل العمليات الكبيرة اسمه endfeet حول معظم الأوعية الدموية في الدماغ 8 و تعدل BBB النزاهة والهدوء المناعي 9، ونقل نواتج الأيض في الخلايا العصبية 10، ولحث على اقتران ضيق بين نشاط الخلايا العصبية و تدفق الدم 11،12.
القدرة على دراسة الخصائص الجزيئية والخلوية للنظام الدماغية هي حاسمة لتوصيف أفضل مساهمته في علم وظائف الأعضاء والدماغ الفيزيوباثيا. لمعالجة هذه المسألة، وقد وضعت استراتيجيات لعزل نظام الدماغية في المخ، والتي تسمح لإعداد سليمة شظايا سفينة الدماغ. الدماغي السفينة صوقد وصفت urification في البداية باستخدام العقول البقري 13 وتحسنت وتتكيف مع الأنواع الأخرى، وخاصة القوارض 14. في هذه الدراسة الأخيرة، تم إدخال استخدام مرشحات من أحجام مختلفة لفصل الأوعية الدماغية في لكسور التخصيب في السفن من أقطار مختلفة. ومن المثير للاهتمام، في مثل هذه الاستعدادات، تبقى الخلايا البطانية خصائص الأيض الخاصة 15، وظائف نقل 16 والاستقطاب 17. هنا، نحن تصف بالتفصيل هذا البروتوكول، وكذلك إثبات أن السفن معزولة تحتفظ معظم من هم في الهياكل الموقع. الخلايا البطانية تبقى مرتبطة من قبل منعطفات ضيقة ومحاطة الصفيحة القاعدية مستمرة. Pericytes وخلايا العضلات الملساء لا تزال تعلق على طبقة الخلايا البطانية، وكذلك الأغشية المحيطة بالأوعية نجمية. ومع ذلك، يتم استبعاد الخلايا النجمية، الخلايا الدبقية، الخلايا العصبية و oligodendrocytes. وأخيرا، نحن تصف الإجراء لأداء المناعية على السفن الدماغ معزولة. </P>
حتى الآن وقد أجريت معظم الدراسات الجزيئية والخلوية المتعلقة بنظام الدماغية على تنقية خلايا الدماغ سفينة فصلها باستخدام سلالات مراسل الماوس محددة الخلية أو الإجراءات القائمة على المناعية 18،19 الفرز الخلية. على الرغم من أن هذه التقنيات تتيح للعزلة من الذهب الخالص تقريبا السكان الخلية الدماغية، الخلايا المعزولة يفقد تماما في الموقع التشكل والتفاعل، وهذا بدوره يؤثر بشكل كبير ممتلكاتهم الجزيئية والخلوية. وصف بروتوكول هنا، مما يسمح لعزل شظايا الدماغية بأكملها دون الحاجة للأجسام معينة أو بقع الماوس المعدلة وراثيا، ويقدم بديلا جيدا كما في الهيكل العام للالأوعية الدماغية المعزولة يتم حفظها، وبالتالي تقليل تداعيات على ممتلكاتهم الجزيئية. ويمكن بعد ذلك أن تستخدم سفن معزولة لدراسة النشاط الجيني، تخليق البروتين والتنظيم على BBB كما هو موضح في الآونة الأخيرة 20،21 </suP>. وأخيرا، بالمقارنة مع الليزر التقاط تسليخ مجهري 22،23 هذا البروتوكول غير مكلفة وسهلة لأداء وقدرة على التكيف بسرعة إلى أي مختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
حاجز الدم في الدماغ وينظم مرور المواد الفسيولوجية داخل وخارج الجهاز العصبي المركزي، ويحمي ضد المواد الضارة المحتملة الحالية في الدم. وتشارك في العديد من الأمراض CNS، بما في ذلك أمراض الاعصاب 2 وأورام الدماغ 28. نفاذية منخفضة للغاية من BBB أيضا يعيق مرور العوا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل Labex MemoLife والتي ARSEP (مؤسسة صب L'مساعد à لا بحوث سور لا يتصلب أون لويحات)
Materials
| Tissue Grinder Size C | Thomas scientific | 3431E25 | |
| centrifuge 5415 R | Eppendorf | ||
| centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811000320 | |
| High-performance, Modular Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Compact System Provides High Quality Leica LED1000 | Leica | LED1000 | |
| low binding tips (P1000) | Sorenson BioScience | 14200T | |
| Swinnex 47mm filter holder PP 8/Pk | Millipore | SX0004700 | |
| Nylon net filter disc Hydrophilic 20µm 47mm 100/Pk | Millipore | NY2004700 | |
| Nylon net filter disc Hydrophilic 100µm 47mm 100/Pk | Millipore | NY1H04700 | |
| Standard Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B150-86-7.5 | |
| Microscope Slides | Thermo Scientific | 1014356290F | |
| Cover Slips, Thickness 1 | Thermo Scientific | P10143263NR1 | |
| 0,2 ml Thin-walled tubes and domed cap | Thermo Scientific | AB-0266 | |
| PARAFILM® M (roll size 4 in. × 125 ft) | Sigma | P7793-1EA | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Life technology | 14175-129 | |
| HEPES (1M) | Life technology | 15630056 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 | Sigma | 31390 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| PBS 10X | Euromedex | ET330 | |
| 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton™ X-100 | Sigma | X100 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma | 14533 | |
| Mounting medium Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor® 488 Conjugate; Dilution 1/100 | Life technology | I21411 | |
| Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 | kindly provided by Dr Markus A Ruegg | ||
| Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) | Life technology | 33-9100 | dilution 1:500 |
| Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) | Sigma | A2547 | dilution 1:500 |
| Anti GFAP (mouse, clone GA5) | Sigma | G3893 | dilution 1:500 |
| Anti AQP4 (rabbit) | Sigma | A5971 | dilution 1:500 |
| Anti Cx43 (mouse, Clone 2) | BD Biosciences | 610061 | dilution 1:500 |
| Anti Olig2 (rabbit) | Millipore | AB9610 | dilution 1:200 |
| Anti NF-M (mouse) | provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland. | dilution 1:10 | |
| Anti Iba1 (rabbit) | Wako | 019-19741 | dilution 1:400 |
| Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A11029 | dilution 1:2000 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 488 conjugate | Life technology | A11034 | dilution 1:2000 |
| Alexa Fluor® 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A21424 | dilution 1:2000 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 555 conjugate | Life technology | A21429 | dilution 1:2000 |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
- Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12 (1-2), 54-61 (2007).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
- Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
- Hall, C. N., Reynell, C., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
- Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: an electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Allaman, I., Brain Magistretti, P. J. Energy Metabolism: Focus on Astrocyte-Neuron Metabolic Cooperation. Cell Metabolism. 14 (6), 724-738 (2011).
- Attwell, D., Buchan, A. M., Charpak, S., Lauritzen, M., MacVicar, B. A., Newman, E. A. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
- Iadecola, C., Nedergaard, M. Glial regulation of the cerebral microvasculature. Nature Neuroscience. 10 (11), 1369-1376 (2007).
- Brendel, K., Meezan, E., Carlson, E. C. Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex. Science (New York, N.Y.). 185 (4155), 953-955 (1974).
- Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. -. M., Declèves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
- Dallaire, L., Tremblay, L., Béliveau, R. Purification and characterization of metabolically active capillaries of the blood-brain barrier. Biochemical Journal. 276 ((Pt 3)), 745 (1991).
- Boado, R. J., Pardridge, W. M. The brain-type glucose transporter mRNA is specifically expressed at the blood-brain barrier. Biochemical and Biophysical Research Communications. 166 (1), 174-179 (1990).
- Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: Distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Research. 192 (1), 17-28 (1980).
- Daneman, R., Zhou, L., Agalliu, D., Cahoy, J. D., Kaushal, A., Barres, B. A. The Mouse Blood-Brain Barrier Transcriptome: A New Resource for Understanding the Development and Function of Brain Endothelial Cells. PLoS ONE. 5 (10), e13741 (2010).
- Zhang, Y., Chen, K., et al. An RNA-Sequencing Transcriptome and Splicing Database of Glia, Neurons, and Vascular Cells of the Cerebral Cortex.. The Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Boulay, A. -. C., Saubaméa, B., et al. The Sarcoglycan complex is expressed in the cerebrovascular system and is specifically regulated by astroglial Cx30 channels. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 9 (2015).
- Boulay, A. -. C., Mazeraud, A., et al. Immune quiescence of the brain is set by astroglial Connexin 43. The Journal of Neuroscience. 35 (10), 4427-4439 (2015).
- Ball, H. J., McParland, B., Driussi, C., Hunt, N. H. Isolating vessels from the mouse brain for gene expression analysis using laser capture microdissection. Brain Research Protocols. 9 (3), 206-213 (2002).
- Murugesan, N., Macdonald, J., Ge, S., Pachter, J. S. Probing the CNS microvascular endothelium by immune-guided laser-capture microdissection coupled to quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 755, 385-394 (2011).
- Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. Journal of Visualized Experiments. (93), (2014).
- Winkler, E. A., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Central nervous system pericytes in health and disease. Nature Neuroscience. 14 (11), 1398-1405 (2011).
- Ezan, P., André, P., et al. Deletion of astroglial connexins weakens the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2012).
- Simard, M., Arcuino, G., Takano, T., Liu, Q. S., Nedergaard, M. Signaling at the gliovascular interface. The Journal of neuroscience. 23 (27), 9254-9262 (2003).
- Dubois, L. G., Campanati, L., et al. Gliomas and the vascular fragility of the blood brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 418 (2014).
- Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. Isolation of metabolically active capillaries from rat brain1,2. Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).
- Hjelle, J. T., Baird-Lambert, J., Cardinale, G., Specor, S., Udenfriend, S. Isolated microvessels: the blood-brain barrier in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4544 (1978).
- Head, R. J., Hjelle, J. T., Jarrott, B., Berkowitz, B., Cardinale, G., Spector, S. Isolated brain microvessels: preparation, morphology, histamine and catecholamine contents. Blood Vessels. 17 (4), 173-186 (1980).
- Pardridge, W. M., Sakiyama, R., Coty, W. A. Restricted transport of vitamin D and A derivatives through the rat blood-brain barrier. Journal of neurochemistry. 44 (4), 1138-1141 (1985).
- Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).
- Luo, J., Yin, X., Sanchez, A., Tripathy, D., Martinez, J., Grammas, P. Purification of endothelial cells from rat brain. Methods Mol Biol. 1135, 357-364 (2014).
- Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. J Neurosci Methods. 207 (1), 80-85 (2012).
- Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
- Bowman, P. D., Betz, A. L., et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain. In Vitro. 17 (4), 353-362 (1981).
- Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells. Pharmaceutical Research. 24 (4), 688-694 (2007).
- Warren, M. S., Zerangue, N., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacological Research. 59 (6), 404-413 (2009).
- Geier, E. G., Chen, E. C., et al. Profiling Solute Carrier Transporters in the Human Blood-Brain Barrier. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 94 (6), 636-639 (2013).
- Seetharaman, S., Barrand, M. A., Maskell, L., Scheper, R. J. Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates. Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1151-1159 (1998).
- Urich, E., Patsch, C., Aigner, S., Graf, M., Iacone, R., Freskgard, P. O. Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier. Sci Rep. 3, 1500 (2013).
