마우스 뇌 혈관의 정화
Summary
We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain’s vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.
Abstract
뇌, 혈관 시스템의 대부분은 선택적 장벽 이루어져, 뇌 및 혈액 사이의 분자 및 면역 세포의 교환을 조절 혈액 – 뇌 장벽 (BBB). 더욱이, 거대한 신경 대사 요구 혈류 매 순간 규제를 필요로한다. 특히,이 규정의 이상은 대부분 뇌 병변의 병인 특징이다; 뇌 종양,뿐만 아니라 다발성 경화증, 수막염 및 패혈증 – 유도 된 뇌 기능 장애와 같은 염증성 질환 : 아교 모세포종, 뇌졸중, 부종, 간질, 퇴행성 질환 (파킨슨 병, 알츠하이머 병 EX)를 포함. 따라서, 뇌 혈관 생리학 변조 시그널링 이벤트 이해 주요 과제이다. 뇌 혈관 시스템을 구성하는 다양한 세포 유형의 세포 및 분자 특성에 많은 통찰력 갓 해리 뇌 조직에서 정렬 차 또는 배양 세포로부터 얻어 질 수있다. 그러나,휴대 극성, 형태 및 세포 간 관계와 같은 속성은 준비에서 유지되지 않습니다. 우리는 여기에서 설명하는 프로토콜은 구조적 일체 성을 유지하면서, 뇌 혈관 단편을 정제하기 위해 설계된다. 우리는 고립 된 선박이 연속 기저 얇은 판에 둘러싸여 꽉 접합에 의해 밀봉 내피 세포로 구성되어 있음을 보여준다. 주위 세포는 평활근 세포뿐만 아니라 혈관 주위 성상 endfeet 막은 내피 층에 부착 된 상태로 유지. 마지막으로, 우리는 정제 뇌 혈관에 면역 염색 실험을 수행하는 방법에 대해 설명합니다.
Introduction
중추 신경계 (CNS)의 적절한 기능이 고도로 조절 세포 외 환경을 요구하고, 그 요구는 다른 대사 기관 (1)에 비해 높아지고있다. CNS는 일반적으로 말초 기관에 무해하지만,에, 신경 독성 화학 물질의 넓은 범위에 매우 민감하다. 정확한 기능을 보장하기 위해, CNS '혈관의 대부분의 내피 장벽을 형성하고; 분자 및 이온의 흐름뿐만 아니라 혈액 및 뇌 사이의 면역 세포의 통과를 제어하는 혈액 – 뇌 장벽 (BBB)은, 이렇게 저해 치료함으로써 적절한 항상성 (2)를 유지하지만, 또한 치료제의 침입을 제한 의 신경 학적 장애 3. 세포 수준에서, BBB는 주로 혈관 내피 세포, 유출 수송의 편광 표현과 매우 낮은 트랜스 사이토 속도 4 사이의 광범위한 꽉 접합에 의해 유지된다. 속성 및 BBB의 기능은 대부분 NE에 의해 유도되는ighboring 세포 4. 특히, 혈관 주위 세포는 BBB 5,6- 유도 및 유지에 중요한 역할을한다. 대형 선박을 둘러싼 평활근을 수축으로 세포이기 때문에, 혈관 주위 세포는 혈액의 흐름을 조절 7. 마지막으로, 성상 세포, 뇌의 주요 아교 세포, endfeet 주변라는 이름의 큰 프로세스를 보내 뇌 혈관 (8)의 대부분 BBB 무결성 및 면역 정지 (9), 신경 (10)에 대사 산물의 이동을 조절하고 신경 세포의 활동 사이의 밀접한 결합을 유도하고 혈류 11,12.
뇌 혈관 시스템의 분자 및 세포 특성을 연구 할 수있는 능력은 뇌 생리학과 physiopathology에 기여를 더 나은 특성을하는 것이 중요하다. 이 문제를 해결하기 위해, 뇌 혈관 뇌의 시스템을 분리 전략은 그대로 뇌 혈관 단편의 제조를 허용하는 개발되었다. 뇌 혈관 Purification 처음 특히 설치류 (14)에, 다른 종에 소 뇌 (13)를 사용하여 설명하고 개선 적응했다. 마지막 연구에서, 가변 크기의 필터의 사용은 다른 직경의 혈관이 풍부한 분획으로 뇌 혈관을 구분하기 위해 도입되었다. 흥미롭게도, 이러한 준비에, 내피 세포는 신진 대사 특성 (15), 수송 기능 (16)과 편광 (17)를 유지했다. 여기서는 자세하게 설명 프로토콜을 추가로 절연 혈관 시츄 그들의 구조의 대부분을 보유 함을 입증. 내피 세포가 단단히 접합으로 연결하고 연속 기저판에 의해 둘러싸여 유지. 주연 세포와 평활근 세포는 내피 층뿐만 아니라 혈관 주위 성상 세포 막에 부착 된 상태로 유지. 그러나, 성상 세포, 미세 아교 세포, 신경 세포 및 희소 돌기 아교 세포는 제거된다. 마지막으로, 우리는 고립 된 뇌 혈관에 면역 염색 수행하는 절차를 설명합니다. </P>
지금까지 뇌 혈관 시스템에 관한 분자 세포 연구의 대부분은 해리에 의해 정제하여 뇌 혈관 세포에서 수행 된 세포 – 세포 분류 특정 리포터 마우스 균주 또는 면역 – 기반 방법을 사용하여 18, 19. 이러한 기술은 거의 순수한 뇌 세포 인구의 격리를 위해 수 있지만, 분리 된 세포는 완전히 다시 크게 분자 및 세포 특성에 영향을 미치는 그들의 현장에서 형태와 상호 작용을 잃게됩니다. 이 프로토콜은 특정 항체 또는 유전자 변형 마우스 얼룩의 필요없이 전체 뇌 조각의 분리를 허용, 여기에 설명 된 분자 특성에 영향을 줄이는 따라서, 보존되어 고립 된 뇌 혈관의 전체 구조와 같은 좋은 대안을 제공합니다. 최근에 기술 된 바와 같이 (20, 21)를 절연 용기는 BBB에서 유전자 활성, 단백질 합성 및 조절을 연구에 사용될 수있는 </suP>. 마지막으로, 레이저 캡처 미세 절제 22, 23에 비해 본 프로토콜은 저렴 수행하기 쉽고 모든 실험실에 빠르게 적응할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
혈액 – 뇌 장벽의 CNS 내 및 생체 물질의 흐름을 조절 및 혈액에 존재하는 유해 물질에 대해 자신을 보호. 그것은 신경 퇴행성 질환 2, 뇌종양 (28)를 포함하여 여러 중추 신경계 병변에 참여하고있다. BBB의 매우 낮은 투과율 역시 신경 세포 및 뇌 연구 (3)의 매우 활성 인 필드에 대해 유해한 영향을 가역적으로 BBB를 열하려는 방법의 개발을 목표로 치료제의 통과를 방해한다. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 LABEX MemoLife에 의해 ARSEP에 의해 지원되었다 (Fondation 라 공들인 쉬르 라 sclérose EN 플라크 라모 보좌관을 부어)
Materials
| Tissue Grinder Size C | Thomas scientific | 3431E25 | |
| centrifuge 5415 R | Eppendorf | ||
| centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811000320 | |
| High-performance, Modular Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Compact System Provides High Quality Leica LED1000 | Leica | LED1000 | |
| low binding tips (P1000) | Sorenson BioScience | 14200T | |
| Swinnex 47mm filter holder PP 8/Pk | Millipore | SX0004700 | |
| Nylon net filter disc Hydrophilic 20µm 47mm 100/Pk | Millipore | NY2004700 | |
| Nylon net filter disc Hydrophilic 100µm 47mm 100/Pk | Millipore | NY1H04700 | |
| Standard Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B150-86-7.5 | |
| Microscope Slides | Thermo Scientific | 1014356290F | |
| Cover Slips, Thickness 1 | Thermo Scientific | P10143263NR1 | |
| 0,2 ml Thin-walled tubes and domed cap | Thermo Scientific | AB-0266 | |
| PARAFILM® M (roll size 4 in. × 125 ft) | Sigma | P7793-1EA | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Life technology | 14175-129 | |
| HEPES (1M) | Life technology | 15630056 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 | Sigma | 31390 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| PBS 10X | Euromedex | ET330 | |
| 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton™ X-100 | Sigma | X100 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma | 14533 | |
| Mounting medium Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor® 488 Conjugate; Dilution 1/100 | Life technology | I21411 | |
| Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 | kindly provided by Dr Markus A Ruegg | ||
| Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) | Life technology | 33-9100 | dilution 1:500 |
| Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) | Sigma | A2547 | dilution 1:500 |
| Anti GFAP (mouse, clone GA5) | Sigma | G3893 | dilution 1:500 |
| Anti AQP4 (rabbit) | Sigma | A5971 | dilution 1:500 |
| Anti Cx43 (mouse, Clone 2) | BD Biosciences | 610061 | dilution 1:500 |
| Anti Olig2 (rabbit) | Millipore | AB9610 | dilution 1:200 |
| Anti NF-M (mouse) | provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland. | dilution 1:10 | |
| Anti Iba1 (rabbit) | Wako | 019-19741 | dilution 1:400 |
| Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A11029 | dilution 1:2000 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 488 conjugate | Life technology | A11034 | dilution 1:2000 |
| Alexa Fluor® 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A21424 | dilution 1:2000 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 555 conjugate | Life technology | A21429 | dilution 1:2000 |
References
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