Reinigung von Maus-Hirngefäße

Summary

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain’s vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Abstract

Im Gehirn, die meisten der Gefäßsystem besteht aus einem selektiven Schranke, die Blut-Hirn-Schranke (BBB), die den Austausch von Molekülen und Immunzellen zwischen dem Gehirn und dem Blut reguliert. Darüber hinaus erfordert die große neuronale metabolischen Bedarf einen Moment zu Moment Regulation des Blutflusses. Bemerkenswert ist, Anomalien dieser Regelungen sind ätiologische Markenzeichen der meisten Hirnerkrankungen; einschließlich Glioblastom, Schlaganfall, Ödeme, Epilepsie, degenerative Erkrankungen (Beispiel: Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit), Hirntumoren sowie entzündlichen Erkrankungen, wie Multiple Sklerose, Meningitis und Sepsis-induzierten Hirnfunktionsstörungen. So, das Verständnis der Signalwege Modulation der zerebrovaskulären Physiologie ist eine große Herausforderung. Viel Einblick in die zellulären und molekularen Eigenschaften der verschiedenen Zelltypen, die den zerebrovaskulären System besteht aus einer Primärkultur oder Zellsortierung von frisch gewonnenen Hirngewebe gewonnen werden. Jedoch,Eigenschaften wie die Zellpolarität, Morphologie und inter Beziehungen nicht in solchen Zubereitungen gehalten. Das Protokoll, das wir beschreiben soll Hirngefäß-Fragmente zu reinigen, während die strukturelle Integrität. Wir zeigen, dass isolierte Gefäße bestehen aus Endothelzellen durch Tight Junctions, die durch eine kontinuierliche Basallamina umgeben sind versiegelt. Perizyten bleiben glatten Muskelzellen sowie die perivaskuläre Astrozyten Endfüßen Membranen Endothelschicht befestigt. Schließlich beschreiben wir, wie Immunfärbung Experimente an gereinigt Hirngefäße durchzuführen.

Introduction

Die einwandfreie Funktion des zentralen Nervensystems (ZNS) erfordert einen stark regulierten extrazellulären Umgebung, und seine metabolischen Anforderungen sind riesig im Vergleich zu anderen Organen ^1. Das ZNS ist auch extrem empfindlich gegenüber einer Vielzahl von Chemikalien, in der Regel unschädlich für periphere Organe, sondern sie neurotoxische. Um eine einwandfreie Funktion zu gewährleisten, bildet der größte Teil der CNS 'Gefäßsystem eine Endothelbarriere; die Blut-Hirn-Schranke (BBB), die den Fluss der Moleküle und Ionen sowie die Passage von Immunzellen, die zwischen dem Blut und dem Gehirn steuert, wodurch die richtige Homöostase ² beibehalten, sondern auch die Eingabe von therapeutischen Arzneimitteln einschränkende Weise behindern Behandlungen neurologische Störungen ^3. Auf zellulärer Ebene ist die BBB hauptsächlich durch umfangreiche tight junctions zwischen Endothelzellen, polarisierte Expression von Efflux-Transporter und einem sehr niedrigen Transzytose Rate ⁴ aufrechterhalten. Eigenschaften und Funktionen der BBB sind meist von ne induzierteighboring ^Zellen 4. Insbesondere spielen Perizyten eine wichtige Rolle bei der Induktion und Aufrechterhaltung des BBB ^5,6. Als kontraktilen Zellen Perizyten, regulieren auch die Durchblutung ^{7 als} die glatten Muskelzellen umgebenden großen Gefäßen zu tun. Schließlich Astrozyten, die großen gliale Zellen des Gehirns, zu senden große Prozesse Endfüßen herum gestattet meisten Gehirngefäß ^{8 und} modulieren BBB Integrität und Immun quiescence ^9, den Transfer von Stoffwechselprodukten der Neuronen ^{10 und} induzieren die enge Kopplung von neuronaler Aktivität und Blutung ^11,12.

Die Fähigkeit, die molekularen und zellulären Eigenschaften des zerebrovaskulären Systems zu studieren, ist entscheidend, um eine bessere Charakterisierung ihres Beitrags zur Gehirnphysiologie und Arzneimitteltherapie. Um diese Frage anzugehen, Strategien, um das Gehirn die zerebrovaskuläre System zu isolieren sind entwickelt worden, die für die Herstellung von intakten Gehirn Schiffes Fragmente zu ermöglichen. Hirngefäßes purification wurde anfänglich unter Verwendung von Rinder Gehirne ¹³ beschrieben und verbessert und an andere Spezies, insbesondere Nagetieren ^14. In dieser letzten Untersuchung wurde die Verwendung von Filtern unterschiedlicher Größe eingebracht, um den Hirngefäßen in den Fraktionen in Gefäße unterschiedlicher Durchmesser angereichert trennen. Interessant ist, dass in solchen Zubereitungen, hielt Endothelzellen ihren metabolischen Eigenschaften ^15, Transporter Funktionen ^{16 und 17} Polarisations. Hier beschreiben wir im Detail dieses Protokoll und weiter zu zeigen, dass isolierte Gefäße behalten die meisten ihrer in situ-Strukturen. Endothelzellen bleiben tight junctions verbunden und durch eine kontinuierliche Basallamina umgeben. Perizyten und Zellen der glatten Muskulatur bleiben der Endothelschicht sowie perivaskuläre Astrozyten Membranen angebracht. Jedoch Astrozyten Mikroglia-Zellen, Neuronen und Oligodendrozyten eliminiert. Schließlich beschreiben wir ein Verfahren durchzuführen Immunfärbung auf isolierte Hirngefäße. </p>

Bis jetzt die meisten der molekularen und zellulären Untersuchungen zur zerebrovaskulären Systems haben auf gereinigt Hirngefäßzellen durch distanzierte geführt Zellsortierung unter Verwendung von zellspezifischen Reportermausstämmen oder Immunfärbung basierte Verfahren ^18,19. Obwohl diese Techniken können zur Isolierung von fast reinem zerebrovaskulären Zellpopulationen, isolierte Zellen vollständig verlieren ihre in situ Morphologie und Wechselwirkungen, die wiederum stark ihre molekularen und zellulären Eigenschaften betrifft. Das hier beschriebene Protokoll, so dass für die Isolierung von Gesamt zerebrovaskulären Fragmente ohne Notwendigkeit von spezifischen Antikörpern oder transgene Maus Flecken, bietet eine gute Alternative, da die Gesamtstruktur der isolierten Hirngefäße konserviert somit Verminderung Auswirkungen auf ihre molekularen Eigenschaften. Isolated Schiffe könnten dann für die Untersuchung der Genaktivität, Proteinsynthese und Regulierung an der BBB verwendet werden, wie kürzlich beschrieben ^20,21 </sup>. Schließlich, im Vergleich zu Laser Mikrodissektion ^22,23 Dieses Protokoll ist kostengünstig, einfach durchzuführen und in jedem Labor schnell anpassungsfähig.

Protocol

1. Lösungen und Materialien Bereiten Isolationsgefäß Lösungen: B1, fügen Sie 1,5 ml HEPES 1M zu 150 ml HBSS; B2, fügen 3,6 g Dextran zu 20 ml B1; B3, wird 1 g BSA in 100 ml B1. Ändern Sie den Filterhalter durch das Schneiden des Boden off der oberen Verschraubung Teil. Bereiten Immunfärbung Lösungen: Fixierungslösung, 4% Paraformaldehyd in PBS pH 7,4; Permeabilisierung / Blockierlösung, verdünnter Ziegenserum zu 5% und Triton X100 auf 0,25% in PBS pH-Wert 7,4. Anmerkung:…

Representative Results

Hier haben wir ein Protokoll, so dass für die mechanische Isolierung des Hirngefäße 14 zu beschreiben. Abbildung 1 fasst die wichtigsten Schritte dieser Technik. Die Architektur der Hirngefäße ist komplex und umfasst mehrere Zelltypen, dh, Endothelzellen von tight junctions verschlossen und von Perizyten, glatte Muskelzellen und Astrozyten Fußfortsätzen 9 umgeben. So nach der Isolierung der Gehirngefäße, war es unser Ziel, die Struktur des gereinigten Gefäße dur…

Discussion

Die Blut-Hirn-Schranke regelt den Durchgang von physiologischen Substanzen in und aus dem ZNS und schützt sie vor im Blut vorhandenen möglicherweise schädlichen Substanzen. Es wird in verschiedenen ZNS-Erkrankungen beteiligt, darunter neurodegenerative Erkrankungen ^{2 und} Hirntumoren ^28. Der extrem niedrige Durchlässigkeit des BBB behindert auch den Durchgang von Therapeutika gezielt Nervenzellen und die Entwicklung von Methoden der Absicht, reversibel öffnen Sie die BBB ohne nachteilige Folgen…

Materials

Tissue Grinder Size C	Thomas scientific	3431E25
centrifuge 5415 R	Eppendorf
centrifuge 5810 R	Eppendorf	5811000320
High-performance, Modular Stereomicroscope	Leica	MZ6
Compact System Provides High Quality Leica LED1000	Leica	LED1000
low binding tips (P1000)	Sorenson BioScience	14200T
Swinnex 47mm filter holder PP 8/Pk	Millipore	SX0004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 20µm 47mm 100/Pk	Millipore	NY2004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 100µm 47mm 100/Pk	Millipore	NY1H04700
Standard Wall Borosilicate Tubing	Sutter Instrument	B150-86-7.5
Microscope Slides	Thermo Scientific	1014356290F
Cover Slips, Thickness 1	Thermo Scientific	P10143263NR1
0,2 ml Thin-walled tubes and domed cap	Thermo Scientific	AB-0266
PARAFILM® M (roll size 4 in. × 125 ft)	Sigma	P7793-1EA
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	Life technology	14175-129
HEPES (1M)	Life technology	15630056
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000	Sigma	31390
Bovine serum albumin	Sigma	A2153
PBS 10X	Euromedex	ET330
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28908
Triton™ X-100	Sigma	X100
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst)	Sigma	14533
Mounting medium Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor® 488 Conjugate; Dilution 1/100	Life technology	I21411
Agrin (rabbit) ; dilution 1/400	kindly provided by Dr Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12)	Life technology	33-9100	dilution 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4)	Sigma	A2547	dilution 1:500
Anti GFAP (mouse, clone GA5)	Sigma	G3893	dilution 1:500
Anti AQP4 (rabbit)	Sigma	A5971	dilution 1:500
Anti Cx43 (mouse, Clone  2)	BD Biosciences	610061	dilution 1:500
Anti Olig2 (rabbit)	Millipore	AB9610	dilution 1:200
Anti NF-M (mouse)	provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.		dilution 1:10
Anti Iba1 (rabbit)	Wako	019-19741	dilution 1:400
Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life technology	A11029	dilution 1:2000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 488 conjugate	Life technology	A11034	dilution 1:2000
Alexa Fluor® 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life technology	A21424	dilution 1:2000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 555 conjugate	Life technology	A21429	dilution 1:2000