Summary

Oprensning af musehjerne Fartøjer

Published: November 10, 2015
doi:

Summary

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain’s vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Abstract

I hjernen er de fleste af det vaskulære system består af en selektiv barriere, blod-hjerne-barrieren (BBB), der regulerer udvekslingen af ​​molekyler og immunceller mellem hjernen og blodet. Desuden den enorme neuronal metabolisk behov kræver et øjeblik til øjeblik regulering af blodgennemstrømning. Især abnormaliteter af disse regler er ætiologiske kendetegnende for de fleste hjerne patologier; herunder glioblastom, slagtilfælde, ødem, epilepsi, degenerative sygdomme (ex: Parkinsons sygdom, Alzheimers sygdom), hjernetumorer, samt inflammatoriske tilstande, såsom multipel sklerose, meningitis og sepsis-induceret hjernen dysfunktioner. Således at forstå de signaler begivenheder modulerer cerebrovaskulær fysiologi er en stor udfordring. Meget indsigt i de cellulære og molekylære egenskaber af de forskellige celletyper, der udgør cerebrovaskulær systemet kan opnås fra primær kultur eller cellesortering fra frisk dissocierede hjernevæv. Menegenskaber såsom celle polaritet, morfologi og intercellulære relationer vedligeholdes ikke i sådanne præparater. Den protokol, vi beskriver her, er bestemt til at rense hjernen fartøj fragmenter, samtidig med at den strukturelle integritet. Vi viser, at isolerede fartøjer består af endotelceller er forseglet af tight junctions der er omgivet af en kontinuerlig basal lamina. Pericyter, glatte muskelceller samt de perivaskulære astrocyt endfeet membraner forbliver fastgjort til endothellaget. Endelig beskriver vi, hvordan du udfører Immunofarvning eksperimenter på oprensede hjernen fartøjer.

Introduction

Korrekt funktion af centralnervesystemet (CNS) kræver et stærkt reguleret ekstracellulære miljø, og dens metaboliske krav er store i forhold til andre organer 1. CNS er også yderst følsomme over for en bred vifte af kemikalier, normalt uskadelige for perifere organer, men til det, neurotoksisk. For at sikre korrekt funktion, det meste af CNS 'vaskulatur danner en endothelial barriere; blod-hjerne-barrieren (BBB), som styrer strømmen af molekyler og ioner samt passage af immunceller mellem blodet og hjernen, og dermed bevare korrekt homeostase 2, men også en begrænsning optagelse af terapeutiske lægemidler, hvilket hæmmer behandlinger af neurologiske lidelser 3. På celleniveau, er BBB hovedsageligt oppe af omfattende tætte forbindelser mellem endotelceller, polariseret udtryk for efflux transportvirksomheder og en meget lav transcytose 4. Egenskaber og funktioner i BBB er for det meste fremkaldt af neighboring celler 4. Især pericytter spiller en vigtig rolle i induktion og vedligeholdelse af BBB 5,6. Bliver kontraktile celler, pericytter også regulere blodgennemstrømning 7 som gør de glatte muskelceller omgivende store skibe. Endelig astrocytter, de store gliaceller i hjernen, sende store processer navngivne endfeet omkring de fleste af hjernen vaskulaturen 8 og modulere BBB integritet og immune hviletilstand 9, overførsel af metabolitter neuroner 10 og inducere tætte kobling mellem neuronal aktivitet og blodgennemstrømning 11,12.

Evnen til at studere de molekylære og cellulære egenskaber af cerebrovaskulære system er afgørende for at karakterisere bedre dens bidrag til hjernen fysiologi og fysiopatologi. For at løse dette spørgsmål, er der udviklet strategier til at isolere hjernens cerebrovaskulær system, som gør det muligt for udarbejdelsen af ​​intakte hjerne fartøj fragmenter. Cerebral fartøj purification blev oprindeligt beskrevet ved hjælp af bovine hjerner 13 og forbedret og tilpasset til andre arter, især gnavere 14. I denne sidste undersøgelse blev brugen af ​​filtre af varierende størrelse indført for at adskille hjernen fartøjer på fraktioner beriget med fartøjer med forskellige diametre. Interessant nok i sådanne præparater, endotelceller holdt deres metaboliske egenskaber 15, transportør funktionalitet 16 og polarisering 17. Her beskriver vi i detaljer denne protokol, og yderligere at demonstrere, at isolerede beholdes meste af deres in situ strukturer. Endotelceller forblive forbundet med tight junctions og omgivet af en kontinuerlig basal lamina. Pericyter og glatte muskelceller forbliver fastgjort til endothellaget, samt perivaskulære astrocyt membraner. Imidlertid er astrocytter, mikrogliaceller, neuroner og oligodendrocytter elimineret. Endelig beskriver vi en fremgangsmåde til at udføre immunfarvning på isolerede hjerne fartøjer. </p>

Indtil nu er de fleste af de molekylære og cellulære undersøgelser vedrørende cerebrovaskulær systemet er blevet udført på oprensede hjerne fartøj celler dissocieret ved celle-sortering hjælp celle specifikke reporter musestammer eller Immunofarvning-baserede procedurer 18,19. Selv om disse teknikker giver mulighed for isolering af næsten rene cerebrovaskulære cellepopulationer, isolerede celler mister deres helt in situ morfologi og interaktioner, der på sin side, i høj grad påvirker deres molekylære og cellulære egenskaber. Protokollen beskrevet her, giver mulighed for isolering af hele cerebrovaskulære fragmenter uden behov for specifikke antistoffer eller transgene mus pletter, giver et godt alternativ som den overordnede struktur af isolerede cerebrale kar er bevaret, således mindske konsekvenser for deres molekylære egenskaber. Isolerede fartøjer kan derefter anvendes til at studere genaktivitet, proteinsyntese og regulering på BBB som beskrevet for nylig 20,21 </sup>. Endelig i forhold til laser capture mikrodissektion 22,23 den nuværende protokol er billigt, let at udføre og hurtigt kan tilpasses på alle laboratorier.

Protocol

1. Løsninger og materialer Forbered isolation fartøj løsninger: B1, tilsættes 1,5 ml HEPES 1 M til 150 ml HBSS; B2, tilsættes 3,6 g dextran til 20 ml B1; B3, tilsættes 1 g BSA til 100 ml B1. Ændre filterholderen ved at skære bunden ud for den øverste skruning del. Forbered Immunofarvning løsninger: Fiksering løsning, 4% paraformaldehyd i PBS pH 7,4; Permeabilisering / blokerende opløsning, fortyndes gedeserum til 5% og Triton X100 til 0,25% i PBS pH 7,4. Bemærk: Fikseri…

Representative Results

Her beskriver vi en protokol der giver mulighed for den mekaniske isolation af hjernen fartøjer 14. Figur 1 opsummerer de vigtigste trin i denne teknik. Arkitekturen i hjernen er kompliceret og omfatter flere celletyper, dvs. endotelceller er forseglet af tight junctions og omgivet af pericyter, glatte muskelceller, og astrocyt fodprocesser 9. Således Efter isolering af hjernen fartøjer, vi havde til formål at karakterisere strukturen af ​​oprensede fartøjer ved i…

Discussion

Blod-hjerne-barrieren regulerer passagen af ​​fysiologiske stoffer ind og ud af CNS og beskytter den mod potentielt skadelige stoffer er til stede i blodet. Det er involveret i adskillige CNS patologier, herunder neurodegenerative sygdomme 2 og hjernetumorer 28. Den ekstremt lave permeabilitet i BBB hæmmer også passagen af terapeutiske midler rettet mod neurale celler og udvikling af metoder til hensigt at reversibelt åbne BBB uden skadelige konsekvenser for hjernen er en meget aktiv inden f…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af LABEX MemoLife og af ARSEP (Fondation pour l'aide à la recherche sur la Sclerose da plaques)

Materials

Tissue Grinder Size C Thomas scientific 3431E25
centrifuge 5415 R Eppendorf
centrifuge 5810 R Eppendorf 5811000320
High-performance, Modular Stereomicroscope Leica MZ6
Compact System Provides High Quality Leica LED1000 Leica LED1000
low binding tips (P1000) Sorenson BioScience 14200T
Swinnex 47mm filter holder PP 8/Pk Millipore SX0004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 20µm 47mm 100/Pk Millipore NY2004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 100µm 47mm 100/Pk Millipore NY1H04700
Standard Wall Borosilicate Tubing Sutter Instrument B150-86-7.5
Microscope Slides Thermo Scientific 1014356290F
Cover Slips, Thickness 1 Thermo Scientific P10143263NR1
0,2 ml Thin-walled tubes and domed cap Thermo Scientific AB-0266
 PARAFILM® M (roll size 4 in. × 125 ft) Sigma P7793-1EA
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Life technology 14175-129
HEPES (1M) Life technology 15630056
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 Sigma 31390
Bovine serum albumin Sigma A2153
PBS 10X Euromedex ET330
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free  Thermo Scientific 28908
Triton X-100 Sigma X100
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) Sigma 14533
Mounting medium Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor® 488 Conjugate; Dilution 1/100 Life technology I21411
Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 kindly provided by Dr Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) Life technology 33-9100 dilution 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) Sigma A2547  dilution 1:500
Anti GFAP (mouse, clone GA5) Sigma G3893  dilution 1:500
Anti AQP4 (rabbit) Sigma A5971  dilution 1:500
Anti Cx43 (mouse, Clone  2) BD Biosciences 610061  dilution 1:500
Anti Olig2 (rabbit) Millipore AB9610  dilution 1:200
Anti NF-M (mouse) provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.  dilution 1:10
Anti Iba1 (rabbit) Wako 019-19741  dilution 1:400
Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A11029  dilution 1:2000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 488 conjugate Life technology A11034  dilution 1:2000
Alexa Fluor® 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A21424  dilution 1:2000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 555 conjugate Life technology A21429  dilution 1:2000

References

  1. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
  2. Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  3. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12 (1-2), 54-61 (2007).
  4. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  5. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  6. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  7. Hall, C. N., Reynell, C., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
  8. Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: an electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
  9. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  10. Allaman, I., Brain Magistretti, P. J. Energy Metabolism: Focus on Astrocyte-Neuron Metabolic Cooperation. Cell Metabolism. 14 (6), 724-738 (2011).
  11. Attwell, D., Buchan, A. M., Charpak, S., Lauritzen, M., MacVicar, B. A., Newman, E. A. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
  12. Iadecola, C., Nedergaard, M. Glial regulation of the cerebral microvasculature. Nature Neuroscience. 10 (11), 1369-1376 (2007).
  13. Brendel, K., Meezan, E., Carlson, E. C. Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex. Science (New York, N.Y.). 185 (4155), 953-955 (1974).
  14. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. -. M., Declèves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  15. Dallaire, L., Tremblay, L., Béliveau, R. Purification and characterization of metabolically active capillaries of the blood-brain barrier. Biochemical Journal. 276 ((Pt 3)), 745 (1991).
  16. Boado, R. J., Pardridge, W. M. The brain-type glucose transporter mRNA is specifically expressed at the blood-brain barrier. Biochemical and Biophysical Research Communications. 166 (1), 174-179 (1990).
  17. Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: Distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Research. 192 (1), 17-28 (1980).
  18. Daneman, R., Zhou, L., Agalliu, D., Cahoy, J. D., Kaushal, A., Barres, B. A. The Mouse Blood-Brain Barrier Transcriptome: A New Resource for Understanding the Development and Function of Brain Endothelial Cells. PLoS ONE. 5 (10), e13741 (2010).
  19. Zhang, Y., Chen, K., et al. An RNA-Sequencing Transcriptome and Splicing Database of Glia, Neurons, and Vascular Cells of the Cerebral Cortex.. The Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  20. Boulay, A. -. C., Saubaméa, B., et al. The Sarcoglycan complex is expressed in the cerebrovascular system and is specifically regulated by astroglial Cx30 channels. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 9 (2015).
  21. Boulay, A. -. C., Mazeraud, A., et al. Immune quiescence of the brain is set by astroglial Connexin 43. The Journal of Neuroscience. 35 (10), 4427-4439 (2015).
  22. Ball, H. J., McParland, B., Driussi, C., Hunt, N. H. Isolating vessels from the mouse brain for gene expression analysis using laser capture microdissection. Brain Research Protocols. 9 (3), 206-213 (2002).
  23. Murugesan, N., Macdonald, J., Ge, S., Pachter, J. S. Probing the CNS microvascular endothelium by immune-guided laser-capture microdissection coupled to quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 755, 385-394 (2011).
  24. Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. Journal of Visualized Experiments. (93), (2014).
  25. Winkler, E. A., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Central nervous system pericytes in health and disease. Nature Neuroscience. 14 (11), 1398-1405 (2011).
  26. Ezan, P., André, P., et al. Deletion of astroglial connexins weakens the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2012).
  27. Simard, M., Arcuino, G., Takano, T., Liu, Q. S., Nedergaard, M. Signaling at the gliovascular interface. The Journal of neuroscience. 23 (27), 9254-9262 (2003).
  28. Dubois, L. G., Campanati, L., et al. Gliomas and the vascular fragility of the blood brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 418 (2014).
  29. Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. Isolation of metabolically active capillaries from rat brain1,2. Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).
  30. Hjelle, J. T., Baird-Lambert, J., Cardinale, G., Specor, S., Udenfriend, S. Isolated microvessels: the blood-brain barrier in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4544 (1978).
  31. Head, R. J., Hjelle, J. T., Jarrott, B., Berkowitz, B., Cardinale, G., Spector, S. Isolated brain microvessels: preparation, morphology, histamine and catecholamine contents. Blood Vessels. 17 (4), 173-186 (1980).
  32. Pardridge, W. M., Sakiyama, R., Coty, W. A. Restricted transport of vitamin D and A derivatives through the rat blood-brain barrier. Journal of neurochemistry. 44 (4), 1138-1141 (1985).
  33. Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).
  34. Luo, J., Yin, X., Sanchez, A., Tripathy, D., Martinez, J., Grammas, P. Purification of endothelial cells from rat brain. Methods Mol Biol. 1135, 357-364 (2014).
  35. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. J Neurosci Methods. 207 (1), 80-85 (2012).
  36. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
  37. Bowman, P. D., Betz, A. L., et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain. In Vitro. 17 (4), 353-362 (1981).
  38. Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
  39. Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells. Pharmaceutical Research. 24 (4), 688-694 (2007).
  40. Warren, M. S., Zerangue, N., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacological Research. 59 (6), 404-413 (2009).
  41. Geier, E. G., Chen, E. C., et al. Profiling Solute Carrier Transporters in the Human Blood-Brain Barrier. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 94 (6), 636-639 (2013).
  42. Seetharaman, S., Barrand, M. A., Maskell, L., Scheper, R. J. Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates. Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1151-1159 (1998).
  43. Urich, E., Patsch, C., Aigner, S., Graf, M., Iacone, R., Freskgard, P. O. Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier. Sci Rep. 3, 1500 (2013).
check_url/53208?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Boulay, A., Saubaméa, B., Declèves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. J. Vis. Exp. (105), e53208, doi:10.3791/53208 (2015).

View Video