JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Rening av Mouse Brain Fartyg

Published: November 10, 2015
doi:
10.3791/53208
, , ,
1Collège de France, Center for Interdisciplinary Research in Biology (CIRB), Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Unité Mixte de Recherche 7241,Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, 2Centre Interdisciplinaire de Recherche en Biologie, 3MEMOLIFE Laboratory of Excellence and Paris Science, Lettre Research University, 4Université Paris Descartes, Faculté de Pharmacie,Université Paris Diderot

Summary

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain’s vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Abstract

I hjärnan är de flesta av det vaskulära systemet består av en selektiv barriär, blod-hjärnbarriären (BBB), som reglerar utbytet av molekyler och immunceller mellan hjärnan och blodet. Dessutom kräver den stora neuronala metaboliska efterfrågan ett ögonblick till ögonblick reglering av blodflödet. Noterbart är, avvikelser i dessa föreskrifter är etiologiska kännetecken flesta hjärn sjukdomar; inklusive glioblastom, stroke, ödem, epilepsi, degenerativa sjukdomar (ex: Parkinsons sjukdom, Alzheimers sjukdom), hjärntumörer, liksom inflammatoriska tillstånd såsom multipel skleros, hjärnhinneinflammation och sepsis inducerad hjärn dysfunktioner. Således, förstå de signaleringshändelser som modulerar cerebrovaskulär fysiologi är en stor utmaning. Mycket insikt i de cellulära och molekylära egenskaper hos de olika celltyper som utgör det cerebrovaskulära systemet kan fås från primär kultur eller cellsortering från nyligen dissocierade hjärnvävnad. Dock,egenskaper såsom cellpolaritet, morfologi och inter relationer inte upprätthålls i sådana preparat. Protokollet som vi beskriver här är utformad för att rena hjärnfartygsfragment, samtidigt som strukturell integritet. Vi visar att isolerade kärl består av endotelceller förseglats av tight junctions som är omgivna av en kontinuerlig basal lamina. Pericyter, glatta muskelceller samt perivaskulära astrocyternas endfeet membran sitter kvar endotelskiktet. Slutligen beskriver vi hur du utför immunfärgning experiment på renade hjärn fartyg.

Introduction

Korrekt funktion av det centrala nervsystemet (CNS) kräver en starkt reglerad extracellulär miljö, och dess metaboliska krav är stora jämfört med andra organ 1. CNS är också extremt känsliga för ett brett spektrum av kemikalier, i allmänhet ofarliga för perifera organ, men att det, neurotoxiskt. För att säkerställa korrekt funktion, de flesta av CNS "kärl bildar en endotel barriär; blod-hjärnbarriären (BBB), som styr flödet av molekyler och joner samt passage av immunceller mellan blodet och hjärnan, och därigenom bibehålla korrekt homeostas 2, men även att begränsa inträdet av terapeutiska läkemedel, på så sätt hämmar behandlingar av neurologiska störningar 3. På cellnivå är BBB främst stöds av omfattande täta förbindelser mellan endotelceller, polariserade uttryck av utflödes transportörer och en mycket låg transcytos hastighet 4. Egenskaper och funktioner hos BBB är mestadels induceras av neighboring celler 4. Särskilt pericyter spela en viktig roll vid inducering och bibehållande av BBB-5,6. Att kontraktila celler, pericyter reglerar också blodflödet 7 som gör glatta muskelceller som omger stora fartyg. Slutligen, astrocyter, de stora gliaceller i hjärnan, skicka stora processer heter endfeet runt större delen av hjärnan kärl 8 och modulera BBB integritet och immun quiescence 9, överföring av metaboliter neuroner 10, och förmå den täta kopplingen mellan neuronal aktivitet och blodflödet 11,12.

Möjligheten att studera de molekylära och cellulära egenskaper hos cerebrovaskulära systemet är avgörande för att karakterisera bättre dess bidrag till hjärnan fysiologi och patofysiologi. För att ta itu med denna fråga, har strategier för att isolera hjärnans cerebrovaskulär system utvecklats, som gör det möjligt för framställning av intakta hjärnfartygsfragment. Cerebral kärl purification ursprungligen beskrivas med nötkreatur hjärnor 13 och förbättras och anpassas till andra arter, i synnerhet gnagare 14. I denna sista studie användning av filter av varierande storlek införts för att separera hjärnan fartyg till fraktioner anrikade på fartyg av olika diametrar. Intressant i sådana preparat, endotelceller hållit sina metaboliska egenskaper 15, transportör funktionalitet 16 och polarisering 17. Här beskriver vi i detalj detta protokoll och ytterligare visar att isolerade fartyg behålla de flesta av deras in situ strukturer. Endotelceller förblir förenade genom tight junctions och omgiven av en kontinuerlig basal lamina. Pericyter och glatta muskelceller sitter kvar endotelskiktet, liksom perivaskulära astrocyternas membran. Emellertid är astrocyter mikrogliaceller, nervceller och oligodendrocyter elimineras. Slutligen beskriver vi ett förfarande för att utföra immunfärgning på isolerade hjärn fartyg. </p>

Hittills har de flesta av de molekylära och cellulära studier beträffande cerebrovaskulära systemet har utförts på renade hjärnkärlceller dissocierade genom cellsortering med hjälp av cellspecifika reporter musstammar eller immunfärgning baserade förfaranden 18,19. Även om dessa tekniker möjliggör för isolering av nästan rena cerebrovaskulära cellpopulationer, isolerade celler förlorar helt deras in situ-morfologi och interaktioner, vilket i sin tur, påverkar i hög grad deras molekylära och cellulära egenskaper. Protokollet som beskrivs här, vilket möjliggör isolering av hela cerebrovaskulära fragment utan behov av specifika antikroppar eller transgena mus fläckar, erbjuder ett bra alternativ eftersom den övergripande strukturen av isolerade cerebrala kärl är konserverad på så sätt, vilket minskar återverkningar på deras molekylära egenskaper. Isolerade fartyg kan sedan användas för att studera geners aktivitet, proteinsyntesen och reglering på BBB som nyligen beskrivits 20,21 </sup>. Slutligen, jämfört med laser capture microdissection 22,23 det nuvarande protokollet är billigt, lätt att utföra och snabbt anpassas för att alla laboratorier.

Protocol

1. Lösningar och material Bered isolering fartygslösningar: B1, tillsätt 1,5 ml HEPES 1M till 150 ml HBSS; B2, tillsätt 3,6 g dextran till 20 ml B1; B3, tillsätt 1 g BSA till 100 ml B1. Ändra filterhållaren genom att skära botten av den övre skruvdelen. Förbered immunfärgning lösningar: fixeringslösning, 4% paraformaldehyd i PBS pH 7,4; Permeabilisering / blockeringslösning, utspädd getserum till 5% och Triton X100 till 0,25% i PBS, pH 7,4. Anmärkning: Fixering beror…

Representative Results

Här beskriver vi ett protokoll som möjliggör mekanisk isolering av hjärnan fartyg 14. Figur 1 sammanfattar de viktigaste stegen i denna teknik. Arkitekturen i hjärnkärlen är komplex och omfattar flera celltyper, det vill säga, endotelceller förseglats av tight junctions och omgivna av pericyter, glatta muskelceller, och astrocyter fot processer 9. Sålunda efter isolering av hjärnkärlen, syftar vi att karaktärisera strukturen hos renade kärl genom immunfärgni…

Discussion

Blod-hjärnbarriären reglerar passage av fysiologiska ämnen i och ut ur CNS och skyddar den mot potentiellt skadliga ämnen som finns i blodet. Det är involverad i flera CNS-patologier, inklusive neurodegenerativa sjukdomar 2 och hjärntumörer 28. Den extremt låga permeabilitet BBB hämmar också passagen av läkemedel inriktade på neurala celler och utveckling av metoder för avsikt att reversibelt öppna BBB utan skadliga konsekvenser för hjärnan är ett mycket aktivt forskningsområde <s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av Labex MemoLife och av ARSEP (Fondation pour l'aide à la recherche sur la sclérose sv plack)

Materials

Tissue Grinder Size C Thomas scientific 3431E25
centrifuge 5415 R Eppendorf
centrifuge 5810 R Eppendorf 5811000320
High-performance, Modular Stereomicroscope Leica MZ6
Compact System Provides High Quality Leica LED1000 Leica LED1000
low binding tips (P1000) Sorenson BioScience 14200T
Swinnex 47mm filter holder PP 8/Pk Millipore SX0004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 20µm 47mm 100/Pk Millipore NY2004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 100µm 47mm 100/Pk Millipore NY1H04700
Standard Wall Borosilicate Tubing Sutter Instrument B150-86-7.5
Microscope Slides Thermo Scientific 1014356290F
Cover Slips, Thickness 1 Thermo Scientific P10143263NR1
0,2 ml Thin-walled tubes and domed cap Thermo Scientific AB-0266
 PARAFILM® M (roll size 4 in. × 125 ft) Sigma P7793-1EA
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Life technology 14175-129
HEPES (1M) Life technology 15630056
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 Sigma 31390
Bovine serum albumin Sigma A2153
PBS 10X Euromedex ET330
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free  Thermo Scientific 28908
Triton™ X-100 Sigma X100
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) Sigma 14533
Mounting medium Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor® 488 Conjugate; Dilution 1/100 Life technology I21411
Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 kindly provided by Dr Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) Life technology 33-9100 dilution 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) Sigma A2547  dilution 1:500
Anti GFAP (mouse, clone GA5) Sigma G3893  dilution 1:500
Anti AQP4 (rabbit) Sigma A5971  dilution 1:500
Anti Cx43 (mouse, Clone  2) BD Biosciences 610061  dilution 1:500
Anti Olig2 (rabbit) Millipore AB9610  dilution 1:200
Anti NF-M (mouse) provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.  dilution 1:10
Anti Iba1 (rabbit) Wako 019-19741  dilution 1:400
Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A11029  dilution 1:2000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 488 conjugate Life technology A11034  dilution 1:2000
Alexa Fluor® 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A21424  dilution 1:2000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 555 conjugate Life technology A21429  dilution 1:2000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
  2. Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  3. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12 (1-2), 54-61 (2007).
  4. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  5. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  6. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  7. Hall, C. N., Reynell, C., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
  8. Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: an electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
  9. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  10. Allaman, I., Brain Magistretti, P. J. Energy Metabolism: Focus on Astrocyte-Neuron Metabolic Cooperation. Cell Metabolism. 14 (6), 724-738 (2011).
  11. Attwell, D., Buchan, A. M., Charpak, S., Lauritzen, M., MacVicar, B. A., Newman, E. A. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
  12. Iadecola, C., Nedergaard, M. Glial regulation of the cerebral microvasculature. Nature Neuroscience. 10 (11), 1369-1376 (2007).
  13. Brendel, K., Meezan, E., Carlson, E. C. Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex. Science (New York, N.Y.). 185 (4155), 953-955 (1974).
  14. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. -. M., Declèves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  15. Dallaire, L., Tremblay, L., Béliveau, R. Purification and characterization of metabolically active capillaries of the blood-brain barrier. Biochemical Journal. 276 ((Pt 3)), 745 (1991).
  16. Boado, R. J., Pardridge, W. M. The brain-type glucose transporter mRNA is specifically expressed at the blood-brain barrier. Biochemical and Biophysical Research Communications. 166 (1), 174-179 (1990).
  17. Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: Distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Research. 192 (1), 17-28 (1980).
  18. Daneman, R., Zhou, L., Agalliu, D., Cahoy, J. D., Kaushal, A., Barres, B. A. The Mouse Blood-Brain Barrier Transcriptome: A New Resource for Understanding the Development and Function of Brain Endothelial Cells. PLoS ONE. 5 (10), e13741 (2010).
  19. Zhang, Y., Chen, K., et al. An RNA-Sequencing Transcriptome and Splicing Database of Glia, Neurons, and Vascular Cells of the Cerebral Cortex.. The Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  20. Boulay, A. -. C., Saubaméa, B., et al. The Sarcoglycan complex is expressed in the cerebrovascular system and is specifically regulated by astroglial Cx30 channels. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 9 (2015).
  21. Boulay, A. -. C., Mazeraud, A., et al. Immune quiescence of the brain is set by astroglial Connexin 43. The Journal of Neuroscience. 35 (10), 4427-4439 (2015).
  22. Ball, H. J., McParland, B., Driussi, C., Hunt, N. H. Isolating vessels from the mouse brain for gene expression analysis using laser capture microdissection. Brain Research Protocols. 9 (3), 206-213 (2002).
  23. Murugesan, N., Macdonald, J., Ge, S., Pachter, J. S. Probing the CNS microvascular endothelium by immune-guided laser-capture microdissection coupled to quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 755, 385-394 (2011).
  24. Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. Journal of Visualized Experiments. (93), (2014).
  25. Winkler, E. A., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Central nervous system pericytes in health and disease. Nature Neuroscience. 14 (11), 1398-1405 (2011).
  26. Ezan, P., André, P., et al. Deletion of astroglial connexins weakens the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2012).
  27. Simard, M., Arcuino, G., Takano, T., Liu, Q. S., Nedergaard, M. Signaling at the gliovascular interface. The Journal of neuroscience. 23 (27), 9254-9262 (2003).
  28. Dubois, L. G., Campanati, L., et al. Gliomas and the vascular fragility of the blood brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 418 (2014).
  29. Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. Isolation of metabolically active capillaries from rat brain1,2. Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).
  30. Hjelle, J. T., Baird-Lambert, J., Cardinale, G., Specor, S., Udenfriend, S. Isolated microvessels: the blood-brain barrier in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4544 (1978).
  31. Head, R. J., Hjelle, J. T., Jarrott, B., Berkowitz, B., Cardinale, G., Spector, S. Isolated brain microvessels: preparation, morphology, histamine and catecholamine contents. Blood Vessels. 17 (4), 173-186 (1980).
  32. Pardridge, W. M., Sakiyama, R., Coty, W. A. Restricted transport of vitamin D and A derivatives through the rat blood-brain barrier. Journal of neurochemistry. 44 (4), 1138-1141 (1985).
  33. Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).
  34. Luo, J., Yin, X., Sanchez, A., Tripathy, D., Martinez, J., Grammas, P. Purification of endothelial cells from rat brain. Methods Mol Biol. 1135, 357-364 (2014).
  35. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. J Neurosci Methods. 207 (1), 80-85 (2012).
  36. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
  37. Bowman, P. D., Betz, A. L., et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain. In Vitro. 17 (4), 353-362 (1981).
  38. Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
  39. Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells. Pharmaceutical Research. 24 (4), 688-694 (2007).
  40. Warren, M. S., Zerangue, N., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacological Research. 59 (6), 404-413 (2009).
  41. Geier, E. G., Chen, E. C., et al. Profiling Solute Carrier Transporters in the Human Blood-Brain Barrier. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 94 (6), 636-639 (2013).
  42. Seetharaman, S., Barrand, M. A., Maskell, L., Scheper, R. J. Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates. Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1151-1159 (1998).
  43. Urich, E., Patsch, C., Aigner, S., Graf, M., Iacone, R., Freskgard, P. O. Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier. Sci Rep. 3, 1500 (2013).

Tags

Brain VasculatureBlood-brain BarrierBrain PathologiesCerebrovascular PhysiologyPrimary CultureCell SortingBrain Vessel PurificationEndothelial CellsTight JunctionsBasal LaminaPericytesSmooth Muscle CellsAstrocyte EndfeetImmunostaining
check_url/53208?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Boulay, A., Saubaméa, B., Declèves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. J. Vis. Exp. (105), e53208, doi:10.3791/53208 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image