Whisker-signalerede blink med øjet Classical Conditioning i Hoved-faste Mus
Summary
The preparation presented here for whisker-signaled eyeblink conditioning in head-fixed mice precisely stimulates specific whiskers while allowing mice to ambulate on a cylindrical treadmill. A whisker stimulation conditioned stimulus (CS) paired with a periorbital shock unconditioned stimulus (US) results in reliable associative learning on this apparatus.
Abstract
Eyeblink conditioning is a common paradigm for investigating the neural mechanisms underlying learning and memory. To better utilize the extensive repertoire of scientific techniques available to study learning and memory at the cellular level, it is ideal to have a stable cranial platform. Because mice do not readily tolerate restraint, they are usually trained while moving about freely in a chamber. Conditioned stimulus (CS) and unconditioned stimulus (US) information are delivered and eyeblink responses recorded via a tether connected to the mouse’s head. In the head-fixed apparatus presented here, mice are allowed to run as they desire while their heads are secured to facilitate experimentation. Reliable conditioning of the eyeblink response is obtained with this training apparatus, which allows for the delivery of whisker stimulation as the CS, a periorbital electrical shock as the US, and analysis of electromyographic (EMG) activity from the eyelid to detect blink responses.
Introduction
Blink med øjet condition er en form for pavlovsk condition og et modelsystem til undersøgelse de neurale mekanismer for associativ indlæring og hukommelse. Det er blevet undersøgt i forskellige arter, herunder mennesker, kaniner, katte, rotter og mus. Paradigmet indebærer præsentationen af to parrede stimuli: en neutral konditioneret stimulus (CS, fx en tone, et lysglimt, eller trikit stimulation), og en anselig ubetinget stimulus (US; fx en luft pust til øjet, eller periorbitalt shock). USA fremkalder et ubetinget, refleksiv blink med øjet respons (dvs. UR). Til sidst, efter flere præsentationer af den parrede CS-USA, emnet lærer at associere CS med USA. Denne læring manifesterer sig i form af en betinget respons (CR), en blink med øjet fremkaldt af CS alene, der går forud for præsentationen af USA.
Blink med øjet condition i spor formularen indeholder en stimulus-interval på et par timerundred millisekunder der adskiller KS og USA (figur 1). Trace condition er en form for deklarativ læring, da det kræver kendskab til de stimulerende uforudsete 1. Den tidsmæssige mellemrum kræver dyret til at holde et neuralt "spor" af CS i forhjernen regioner som hippocampus, for USA og CS til at blive associeret 1-6. Sammen med forhjernen regioner, trace conditioning er også afhængig af cerebellum 7.
Blink med øjet condition er derfor et nyttigt paradigme for undersøgelsen af de mange facetter af hukommelse, herunder erhvervelse, konsolidering, og genfinding. Under blink med øjet condition, er en kontrolgruppe af dyr præsenteret med uparrede stimuli i vilkårlig rækkefølge at teste for pseudoconditioning eller sensibiliserede reaktioner på CS, der kan være forårsaget af amerikanske præsentation alene snarere end en lærd CS-amerikanske forening.
En almindeligt anvendt apparatus for undersøgelsen af blink med øjet condition i gnavere er et kammer, hvor gnavere får lov til at bevæge sig frit under uddannelsen processen 8-10. Med denne type apparat, er en forankring normalt fastgjort til en hovedstykke, der er fastgjort til gnaver kranium. Tøjret muliggør levering af USA (og undertiden CS) og til transmission af dyrets reaktion på disse stimuli (dvs. blink med øjet respons) 10. Tøjret selv kan ændres på basis af typen af stimuli leveret og hvordan registreres den blink med øjet respons.
Grunden til at bruge "frit-bevægelige" tøjrede mus for blink med øjet condition er, at mus kæmpe mod tilbageholdenhed. Skønt andre arter kan være mere modtagelige for tilbageholdenhed, den største fordel ved anvendelse af mus i blink med øjet conditioning eksperimenter er, at størstedelen af tilgængelige genetisk modificerede mutantstammer er musestammer. Ud over at kæmper, komplet restraint af mus resulterer i akut nød. Et hoved-fast mus forberedelse, der minimerer stress vil øge den fysiologiske oplysninger, der kan opnås i løbet af blink med øjet condition. For eksempel vil dette system muliggøre billeddannelse af kortikale neuroner med 2-foton mikroskopi 11.
Head-fikserede præparater er blevet anvendt i tidligere eksperimenter til optisk billeddannelse af cortex gennem aftagelige kraniale implantater, in vivo elektrofysiologiske optagelser af gnaverhjerner med tetrode arrays, to-foton calcium imaging, og også som en platform for blink med øjet konditionering i mus 11 -16.
I hovedet-fikserede system er pålideligt stimulering og optagelser sikres uden fuldstændig fastholdelse af musen (figur 2). En hovedstykket, som blev brugt i det frit bevægelige system er fastgjort til musens kranium. Under træningen er medaljon fastgjort til et stik, der er knyttet til barer ien cylindrisk løbebånd for at stabilisere den gnaver hoved (figur 2A). Den cylindriske løbebånd tillader musen til at hvile behageligt, men hvis musen ønsker det, også gør det muligt at køre eller gå. Med brugen af dette system, kan mus trænes med en knurhår vibrationer CS og en mild periorbital elektrisk stød som USA (figur 1). USA leveres gennem ledninger kirurgisk anbragt under huden lateralt i forhold til øjet. CS leveres via en kam, der er fastgjort til et 2-lags rektangulær bøjning aktuator (figur 2B). Kammen og bøjning aktuator derpå fastgjort til en magnetisk base, der bevæges til den korrekte position under træning og justeres til optimal levering for hvert enkelt dyr. Kammen er positioneret til at skræve de valgte knurhår. Under afgivelse af CS, sendes et signal til den bøjning aktuator, som forskyder kammen og fører til vibration af whiskers 17.
<p class= "jove_content"> Andre stimuli, såsom en tone eller et lysglimt er blevet anvendt som effektive konditionerede stimuli i mus i fortiden 16,18,19. Årsagen bakkenbart stimulation er valgt til CS i denne eksperimentelle paradigme er afhængigheden af murine dyr på deres vibrissae for somatosensoriske information input under udforskning. Whisker stimulation har vist sig at være en pålidelig og effektiv CS 20. På grund af den veletablerede og organiserede kortikale substrat vibrissae systemet (dvs. tønden cortex), knurhår stimulation som CS giver et elegant værktøj til kortlægning kortikale ændringer og plasticitet er forbundet med at lære blink med øjet condition 20,21. Et hoved-fast system giver mulighed for præcis stimulering af udvalgte whiskers at sammenligne svar mellem stimuleret neuroner og neuroner, der modtager input fra ikke-stimulerede knurhår. Endelig er mange stammer af mus udviser aldersrelateret høretab som relativt unge voksne <sup> 22, og øjenlåg lukning under den betingede blink ændrer en visuel CS (selv om en visuel CS gør forbedre problemer med forskrækkelseskasser svar 16). Whisker stimulation er ikke påvirket af nogen af disse komplikationer.Præsenteret her er unikke og vigtige ændringer upon andre hoved-faste præparater til blink med øjet condition, herunder metoder til CS og amerikanske levering og erhvervelse af blink med øjet respons. Pålideligheden af dette apparat og uddannelse paradigme i blink med øjet condition demonstreres ved at lære kurver fra aircondition mus og en forholdsvis flad indlæringskurve fra pseudoconditioned kontroldyr (Figur 7A).
Protocol
Representative Results
Discussion
Klassisk blink med øjet condition er en form for associativ læring, der er et nyttigt redskab til at forstå de neurale substrater underliggende indlæring og hukommelse. Tidligere metoder anvendes til blink med øjet konditionering hos gnavere såsom mus involverede et kammer, der tillod for dyret at bevæge sig frit. Et hoved-fikserede præparat til blink med øjet konditionering i mus, under anvendelse af apparatet beskrevet af Chettih et al. Og Heiney et al. Og senest anvendt i lys-fremkaldte spo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af Department of Defense (W81XWH-13-01-0243) og National Institutes of Health (R37 AG008796). Vi takker Alan Baker i Northwestern Universitys maskinværksted for at bygge head-faste cylinder apparat. Vi takker Dr. Shoai Hattori for hans vejledning i Matlab og Solidworks. Vi takker Dr. John Strøm af LabView software, der styrede eksperimentet.
Materials
| Exervo TeraNova Foam Roller 36" x 6" | Amazon | B002ONUM0E | For cylinder |
| Plexiglas | Custom-made; 1 cm thick | ||
| Metal Rods (12.7mm diameter) | Custom-made | ||
| 4-40 machine screw (.25 in long) | Amazon Supply | B00F33Q8QO | For cylinder |
| Classic Design Hair Comb | Conair | 93505WG-320 | For whisker stimulation |
| 2-Layer Rectangular Bending Actuator | Piezo Systems | T220-A4-303X | For whisker stimulation |
| Solder and Flux Kit | Piezo Systems | MSF-003-NI | For whisker stimulation |
| Magnetic Base | Thor Labs | MB175 | For whisker stimulation |
| Threaded rod for magnetic base | Custom-made | ||
| Strips based on 221 series nylon strip connectors from Electronic Connector Corp. | Custom-made, based on Weiss and Disterhoft, 2008 | ||
| TO-220 Style Transistor | Amazon Supply | B0002ZPZYO | For connector; for the wings |
| Relia-Tac Sockets | Electronic Connector Corp. | 220-S02 | For connector |
| Relia-Tac Pins | Electronic Connector Corp. | 220-P02 | For headpiece |
| 0-80 stainless steel machine screw (1 in. long) | Amazon Supply | B000FN68EE | Locking Screw |
| 0-80 stainless steel machine screw hex nut (5/32 in. thick) | Amazon Supply | B000N2TK7Y | Locking Screw Head |
| Loctite Super Glue-Liquid | Loctite | 1365896 | Cyanoacrylic glue; for the locking screw |
| Quick Setting Epoxy | Ace Hardware | 18613 | For connector and whisker stimulation system |
| Ethernet Cable Wires | Ethernet cable can be taken apart to use the individual wires for the connector | ||
| Polyimide coated stainless steel wires (2 in. long, .005 in. diameter) | PlasticsOne | 005sw/2.0 37365 S-S | For headpiece, EMG and shock wires |
| Stainless steel uncoated wire (.005 in. diameter) | AM Systems | 792800 | For headpiece, ground wires |
| Tenma Variable Autotransformer | Tenma | 72-110 | For the whisker stimulation; rheostat to adjust current to the bending actuator |
| Amplifier | A-M Systems | 1700 | Amplifier for filtering and amplifying EMG signals |
| WPI A385R stimulus isolator | World Precision Instruments | 31405 | For the electrical shock |
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein: Animal Health | 50031 | For surgery; anesthesia |
| Buprenex Injectable CIII | Reckett Benckiser Pharmaceuticals Inc | NDC 12496-0757-1 | For surgery; analgesic |
| Akwa Tears: Lubricant Ophthalmic Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | Artificial tear ointment to prevent dry eyes while under anesthesia |
| Povidine-Iodine Prep Pads | PDI | NDC 10819-3883-1 | For surgery; antiseptic |
| Alcohol Prep Pads | May be purchased from any standard pharmacy | ||
| Stainless steel surgical scalpel handles (no.3) | Integra Miltex | 4-7. | For surgery |
| Stainless steel surgical scalpel blades | Integra Miltex | 4-310 or 4-315 | For surgery; number 10 or 15 scalpel blade |
| 3% Hydrogen Peroxide | May be purchased from any standard pharmacy | ||
| Micro Clip | Roboz | RS-5459 | For surgery, to hold back skin |
| 00-90 stainless steel machine screw (0.0625 in. long) | Amazon Supply | B002SG89X4 | For surgery, to wrap ground wire around |
| Professional Rotary Tool | Walnut Hollow | 29637 | Hand drill for surgery, to drill holes in skull |
| Inverted Cone Burr | Roboz | RS-6282C-34 | Inverted cone burr size 34; for surgery, to drill holes in skull |
| Engraving Cutter Drill Bit | Dremel | 106 | Engraving cutter; 1.6 mm bit; for surgery, to drill holes in skull |
| C&B Metabond-Quick! Cement System "B" Quick Base | Parkell | S398 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System Clear L-Powder | Parkell | S399 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System "C" Universal TBB Catalyst 0.7 ml | Parkell | S371 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System Ceramic Mixing Dish with temperature strip | Parkell | S387 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| Swiss Tweezers, style #5 | World Precision Instruments | 504506 | For surgery |
| Puritan Cotton-Tipped Applicators | VWR International | 10806-005 | For surgery |
| Dental Caulk Grip Cement Kit | Dentsply | 675570 | For surgery; dental cement |
References
- Clark, R. E., Squire, L. R. Classical conditioning and brain systems: the role of awareness. Science. 280 (5360), 77-81 (1998).
- Thompson, R. F., Kim, J. J. Memory systems in the brain and localization of a memory. PNAS. 93 (24), 13438-13444 (1996).
- Solomon, P. R., Vander Schaaf, E. R., Thompson, R. F., Weisz, D. J. Hippocampus and trace conditioning of the rabbit’s classically conditioned nictitating membrane response. Behav Neurosci. 100 (5), 729-744 (1986).
- Moyer, J. R., Deyo, R. A., Disterhoft, J. F. Hippocampectomy disrupts trace eye-blink conditioning in rabbits. Behav Neurosci. 104 (2), 243-252 (1990).
- Weiss, C., Bouwmeester, H., Power, J. M., Disterhoft, J. F. Hippocampal lesions prevent trace eyeblink conditioning in the freely moving rat. Behav Brain Res. 99 (2), 123-132 (1999).
- Weiss, C., Disterhoft, J. F. Exploring prefrontal cortical memory mechanisms with eyeblink conditioning. Behav Neurosci. 125 (3), 318-326 (2011).
- Aiba, A., et al. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mGluR1 mutant mice. Cell. 79 (2), 377-388 (1994).
- Skelton, R. W. Bilateral cerebellar lesions disrupt conditioned eyelid responses in unrestrained rats. Behav Neurosci. 102 (4), 586-590 (1988).
- Takehara, K., Kawahara, S., Takatsuki, K., Kirino, Y. Time-limited role of the hippocampus in the memory for trace eyeblink conditioning in mice. Brain Res. 951 (2), 183-190 (2002).
- Weiss, C., Disterhoft, J. F. Evoking blinks with natural stimulation and detecting them with a noninvasive optical device: A simple, inexpensive method for use with freely moving animals. J Neurosci Meth. 173, 108-113 (2008).
- Royer, S., et al. Control of timing, rate and bursts of hippocampal place cells by dendritic and somatic inhibition. Nature. 15 (5), 769-775 (2012).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Lovett-Barron, M., et al. Dendritic inhibition in the hippocampus supports fear learning. Science. 343 (6173), 857-863 (2014).
- Chettih, S. N., McDougle, S. D., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Adaptive timing of motor output in the mouse: the role of movement oscillations in eyelid conditioning. Front in Integ Neurosci. 5 (72), (2011).
- Heiney, S. A., Wohl, M. P., Chettih, S. N., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Cerebellar-Dependent Expression of Motor Learning during Eyeblink Conditioning in Head-Fixed Mice. J Neurosci. 34 (45), 14845-14853 (2014).
- Siegel, J. J., et al. Trace Eyeblink Conditioning in Mice is Dependent upon the Dorsal Medial Prefrontal Cortex, Cerebellum, and Amygdala: Behavioral Characterization and Functional Circuity. eNeuro. , (2015).
- Galvez, R., Weiss, C., Cua, S., Disterhoft, J. A novel method for precisely timed stimulation of mouse whiskers in a freely moving preparation: application for delivery of the conditioned stimulus in trace eyeblink conditioning. J Neurosci Meth. 177 (2), 434-439 (2009).
- Gruart, A., Sánchez-Campusano, R., Fernández-Guizán, A., Delgado-Garcìa, J. M. A Differential and Timed Contribution of Identified Hippocampal Synapses to Associative Learning in Mice. Cereb Cortex. , (2014).
- Weiss, C., et al. Impaired Eyeblink Conditioning and Decreased Hippocampal Volume in PDAPP V717F Mice. Neurobiol Dis. 11 (3), 425-433 (2002).
- Galvez, R., Weiss, C., Weible, A. P., Disterhoft, J. F. Vibrissa-signaled eyeblink conditioning induces somatosensory cortical plasticity. J Neurosci. 26 (22), 6062-6068 (2006).
- Galvez, R., Weible, A. P., Disterhoft, J. F. Cortical barrel lesions impair whisker-CS trace eyeblink conditioning. Learn & Memory. 14 (1), 94-100 (2007).
- Johnson, K. R., Zheng, Q. Y., Erway, L. C. A Major Gene Affecting Age-Related Hearing Loss Is Common to at Least Ten Inbred Strains of Mice. Genomics. 70 (2), 171-180 (2000).
- Tseng, W., Guan, R., Disterhoft, J. F., Weiss, C. Trace eyeblink conditioning is hippocampally dependent in mice. Hippocampus. 14 (1), 58-65 (2004).
- Joachimsthaler, B., Brugger, D., Skodras, A., Schwarz, C. Spine loss in primary somatosensory cortex during trace eyeblink conditioning. J Neurosci. 35 (9), 3772-3781 (2015).
- Boele, H. J. Cerebellar and extracerebellar involvement in mouse eyeblink conditioning: the ACDC model. Front in Cell Neurosci. 3 (19), (2010).
- Koekkoek, S. K. E., Den Ouden, W. L., Perry, G., Highstein, S. M., De Zeeuw, C. I. Monitoring kinetic and frequency-domain properties of eyelid responses in mice with magnetic distance measurement technique. J Neurophysiol. 88 (4), 2124-2133 (2002).
- Ward, R. L., Flores, L. C., Disterhoft, J. F. Infragranular barrel cortex activity is enhanced with learning. J Neurophysiol. 108 (5), 1278-1287 (2012).
