-Bakkebaard gesignaleerd Eyeblink klassieke conditionering in-Head vaste Muizen
Summary
The preparation presented here for whisker-signaled eyeblink conditioning in head-fixed mice precisely stimulates specific whiskers while allowing mice to ambulate on a cylindrical treadmill. A whisker stimulation conditioned stimulus (CS) paired with a periorbital shock unconditioned stimulus (US) results in reliable associative learning on this apparatus.
Abstract
Eyeblink conditioning is a common paradigm for investigating the neural mechanisms underlying learning and memory. To better utilize the extensive repertoire of scientific techniques available to study learning and memory at the cellular level, it is ideal to have a stable cranial platform. Because mice do not readily tolerate restraint, they are usually trained while moving about freely in a chamber. Conditioned stimulus (CS) and unconditioned stimulus (US) information are delivered and eyeblink responses recorded via a tether connected to the mouse’s head. In the head-fixed apparatus presented here, mice are allowed to run as they desire while their heads are secured to facilitate experimentation. Reliable conditioning of the eyeblink response is obtained with this training apparatus, which allows for the delivery of whisker stimulation as the CS, a periorbital electrical shock as the US, and analysis of electromyographic (EMG) activity from the eyelid to detect blink responses.
Introduction
Oogknipreflex is een vorm van Pavlov van airconditioning en een modelsysteem voor het onderzoeken van de neurale mechanismen van associatief leren en geheugen. Het is onderzocht in diverse diersoorten, waaronder mensen, konijnen, katten, ratten en muizen. Het paradigma betreft de presentatie van twee gepaarde stimuli: een neutrale geconditioneerde stimulus (CS, bijvoorbeeld, een toon, een lichtflits, of snorhaar stimulatie), en een opvallende ongeconditioneerde stimulus (US, bijvoorbeeld, een lucht bladerdeeg voor het oog, of periorbitaal shock). De Amerikaanse ontlokt een ongeconditioneerde, reflexieve eyeblink respons (dwz UR). Uiteindelijk, na een aantal presentaties van de gepaarde CS-US, het onderwerp leert de CS associëren met de Verenigde Staten. Dit leren manifesteert zich in de vorm van een geconditioneerde respons (CR), een eyeblink opgewekt door het CS staan dat de presentatie van de Amerikaanse voorafgaat.
Oogknipreflex in het spoor formulier bevat een stimulus-interval van een paar uurundred milliseconden dat de CS en de VS (figuur 1) scheidt. Trace conditionering is een vorm van declaratief leren omdat daarmee een groter bewustzijn van de stimulus onvoorziene 1 vereist. De tijdelijke kloof moet het dier naar een neuraal 'sporen' van het CS in voorhersenen regio's zoals de hippocampus op orde te houden voor de VS en de CS voor geassocieerde 1-6 geworden. Naast de voorhersenen, trace conditionering is ook afhankelijk van de kleine hersenen 7.
Oogknipreflex is derhalve een bruikbaar model voor het onderzoek van de verschillende aspecten van het geheugen, zoals acquisitie, consolidatie en retrieval. Tijdens oogknipreflex wordt een controlegroep dieren dat met ongepaarde stimuli in willekeurige volgorde te testen op pseudoconditioning of gevoelig reacties op de CS die kunnen worden veroorzaakt door Amerikaanse presentatie alleen dan een geleerde CS-Amerikaanse vereniging.
Een veelgebruikt Apparatus voor het onderzoek oogknipreflex bij knaagdieren is een kamer waarin de knaagdieren mogen tijdens het trainingsproces 8-10 vrij bewegen. Bij dit type inrichting wordt een tuier gewoonlijk bevestigd aan een helm die is bevestigd aan de schedel van de knaagdier. De tuier maakt de afgifte van de VS (en soms de CS) en voor het sturen van een respons van het dier op die stimuli (dwz de eyeblink respons) 10. De tuier zelf kan worden aangepast gebaseerd op het type prikkeling afgegeven en hoe de eyeblink respons wordt geregistreerd.
De reden voor het gebruik van "vrij bewegende" tethered muizen voor oogknipreflex is dat muizen strijden tegen terughoudendheid. Hoewel andere soorten ontvankelijker voor beperking kan zijn, het grote voordeel van het gebruik van muizen in oogknipreflex experimenten is dat de meeste beschikbare genetisch gemodificeerde mutante stammen zijn muizenstammen. In aanvulling op worstelen, compleet restraint muizen resulteert in acute nood. A-head vaste muis preparaat dat stress minimaliseert zou de fysiologische informatie die kan worden verkregen bij oogknipreflex verhogen. Bijvoorbeeld, zou dit systeem beeldvorming van corticale neuronen met 2-foton microscopie 11 mogelijk.
-Head vaste preparaten zijn gebruikt in eerdere experimenten voor optische beeldvorming van de cortex door middel van verwijderbare craniale implantaten in vivo elektrofysiologische opnames van het knaagdier hersenen met tetrode arrays, twee-foton calcium imaging, en ook als een platform voor oogknipreflex bij muizen 11 -16.
In de kop vast net betrouwbaar stimulatie en opnames worden gewaarborgd zonder volledige beperking van de muis (Figuur 2). Een zendspoel zoals die gebruikt bij de vrij bewegende systeem is bevestigd aan de schedel van de muis. Tijdens de training wordt de helm aangebracht op een connector die naar bars dan is bevestigdeen cilindrische loopband om het hoofd van de knaagdier (Figuur 2A) te stabiliseren. De cilindrische loopband laat de muis om comfortabel te rusten, maar als de muis dat wenst, maakt het ook mogelijk om te draaien of te lopen. Met het gebruik van dit systeem kunnen muizen worden getraind met een snorhaar trillingen CS en een lichte periorbitale elektrische schok als de Amerikaanse (figuur 1). De VS geleverd via draden chirurgisch geplaatst onder de huid lateraal van het oog. De CS wordt via een kam die een 2-laags rechthoekige buigen actuator (figuur 2B) is bevestigd. De kam en buigen actuator worden dan bevestigd aan een magnetische basis die tijdens het trainen de juiste positie wordt bewogen en wordt aangepast voor optimale toediening per dier. De kam is gepositioneerd om de geselecteerde snorharen straddle. Tijdens de levering van het CS, wordt een signaal naar de buigende actuator die de kam verplaatst en leidt tot trillingen van de snorharen 17.
<p class= "jove_content"> Andere prikkels, zoals een toon of een lichtflits zijn gebruikt als effectief geconditioneerde stimuli in muizen in het verleden 16,18,19. De reden snorhaar stimulatie wordt gekozen voor de CS in deze experimentele paradigma is de afhankelijkheid van de muizen dieren op hun vibrissae voor somatosensorische informatie-input tijdens de verkenning. Whisker stimulatie is aangetoond dat een betrouwbare en effectieve CS 20 zijn. Bovendien, gezien de gevestigde en georganiseerde corticale substraat van de vibrissae systeem (dat wil zeggen, het vat cortex), snorhaar stimulatie als de CS biedt een elegante tool voor het in kaart brengen van veranderingen en corticale plasticiteit in verband met het leren van oogknipreflex 20,21. A-head vast systeem maakt het mogelijk om de precieze stimulatie van geselecteerde snorharen om reacties tussen gestimuleerde neuronen en neuronen ontvangen input van niet-gestimuleerde snorharen te vergelijken. Tot slot, vele stammen van muizen vertonen leeftijdsgebonden gehoorverlies als relatief jong volwassenen <sup> 22 en ooglid sluiting tijdens de geconditioneerde knipperen verandert een visuele CS (hoewel een visuele CS doet verbeteren problemen met schrikreacties 16). Whisker stimulatie wordt niet beïnvloed door een van deze complicaties.hier gepresenteerde zijn unieke en belangrijke wijzigingen op andere head vaste voorbereidingen voor oogknipreflex, met inbegrip van methoden voor CS en de VS levering, en de overname van de eyeblink respons. De betrouwbaarheid van de inrichting en de training paradigma oogknipreflex blijkt uit leercurven van geconditioneerde muizen en een relatief vlakke leercurve van pseudoconditioned controledieren (Figuur 7A).
Protocol
Representative Results
Discussion
Classical oogknipreflex is een vorm van associatief leren, dat is een nuttig instrument voor het begrijpen van de neurale substraten onderliggende leren en geheugen. Eerdere methoden voor oogknipreflex bij knaagdieren zoals muizen betrof een kamer die toegestaan voor de dieren vrij kunnen bewegen. Een kop vast preparaat voor oogknipreflex in muizen in het door Chettih et al. En Heiney et al. En het meest recent gebruikte beschreven in licht opgewekte trace oogknipreflex in Siegel et al. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door het Ministerie van Defensie (W81XWH-13-01-0243) en de National Institutes of Health (R37 AG008796). Wij danken Alan Baker in Northwestern University's werkplaats voor de bouw van het hoofd vaste cilinder apparaat. Wij danken Dr. Shoai Hattori voor zijn leiding in MATLAB en Solidworks. Wij danken Dr. John voeding voor de LabView software die het experiment gecontroleerd.
Materials
| Exervo TeraNova Foam Roller 36" x 6" | Amazon | B002ONUM0E | For cylinder |
| Plexiglas | Custom-made; 1 cm thick | ||
| Metal Rods (12.7mm diameter) | Custom-made | ||
| 4-40 machine screw (.25 in long) | Amazon Supply | B00F33Q8QO | For cylinder |
| Classic Design Hair Comb | Conair | 93505WG-320 | For whisker stimulation |
| 2-Layer Rectangular Bending Actuator | Piezo Systems | T220-A4-303X | For whisker stimulation |
| Solder and Flux Kit | Piezo Systems | MSF-003-NI | For whisker stimulation |
| Magnetic Base | Thor Labs | MB175 | For whisker stimulation |
| Threaded rod for magnetic base | Custom-made | ||
| Strips based on 221 series nylon strip connectors from Electronic Connector Corp. | Custom-made, based on Weiss and Disterhoft, 2008 | ||
| TO-220 Style Transistor | Amazon Supply | B0002ZPZYO | For connector; for the wings |
| Relia-Tac Sockets | Electronic Connector Corp. | 220-S02 | For connector |
| Relia-Tac Pins | Electronic Connector Corp. | 220-P02 | For headpiece |
| 0-80 stainless steel machine screw (1 in. long) | Amazon Supply | B000FN68EE | Locking Screw |
| 0-80 stainless steel machine screw hex nut (5/32 in. thick) | Amazon Supply | B000N2TK7Y | Locking Screw Head |
| Loctite Super Glue-Liquid | Loctite | 1365896 | Cyanoacrylic glue; for the locking screw |
| Quick Setting Epoxy | Ace Hardware | 18613 | For connector and whisker stimulation system |
| Ethernet Cable Wires | Ethernet cable can be taken apart to use the individual wires for the connector | ||
| Polyimide coated stainless steel wires (2 in. long, .005 in. diameter) | PlasticsOne | 005sw/2.0 37365 S-S | For headpiece, EMG and shock wires |
| Stainless steel uncoated wire (.005 in. diameter) | AM Systems | 792800 | For headpiece, ground wires |
| Tenma Variable Autotransformer | Tenma | 72-110 | For the whisker stimulation; rheostat to adjust current to the bending actuator |
| Amplifier | A-M Systems | 1700 | Amplifier for filtering and amplifying EMG signals |
| WPI A385R stimulus isolator | World Precision Instruments | 31405 | For the electrical shock |
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein: Animal Health | 50031 | For surgery; anesthesia |
| Buprenex Injectable CIII | Reckett Benckiser Pharmaceuticals Inc | NDC 12496-0757-1 | For surgery; analgesic |
| Akwa Tears: Lubricant Ophthalmic Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | Artificial tear ointment to prevent dry eyes while under anesthesia |
| Povidine-Iodine Prep Pads | PDI | NDC 10819-3883-1 | For surgery; antiseptic |
| Alcohol Prep Pads | May be purchased from any standard pharmacy | ||
| Stainless steel surgical scalpel handles (no.3) | Integra Miltex | 4-7. | For surgery |
| Stainless steel surgical scalpel blades | Integra Miltex | 4-310 or 4-315 | For surgery; number 10 or 15 scalpel blade |
| 3% Hydrogen Peroxide | May be purchased from any standard pharmacy | ||
| Micro Clip | Roboz | RS-5459 | For surgery, to hold back skin |
| 00-90 stainless steel machine screw (0.0625 in. long) | Amazon Supply | B002SG89X4 | For surgery, to wrap ground wire around |
| Professional Rotary Tool | Walnut Hollow | 29637 | Hand drill for surgery, to drill holes in skull |
| Inverted Cone Burr | Roboz | RS-6282C-34 | Inverted cone burr size 34; for surgery, to drill holes in skull |
| Engraving Cutter Drill Bit | Dremel | 106 | Engraving cutter; 1.6 mm bit; for surgery, to drill holes in skull |
| C&B Metabond-Quick! Cement System "B" Quick Base | Parkell | S398 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System Clear L-Powder | Parkell | S399 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System "C" Universal TBB Catalyst 0.7 ml | Parkell | S371 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System Ceramic Mixing Dish with temperature strip | Parkell | S387 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| Swiss Tweezers, style #5 | World Precision Instruments | 504506 | For surgery |
| Puritan Cotton-Tipped Applicators | VWR International | 10806-005 | For surgery |
| Dental Caulk Grip Cement Kit | Dentsply | 675570 | For surgery; dental cement |
References
- Clark, R. E., Squire, L. R. Classical conditioning and brain systems: the role of awareness. Science. 280 (5360), 77-81 (1998).
- Thompson, R. F., Kim, J. J. Memory systems in the brain and localization of a memory. PNAS. 93 (24), 13438-13444 (1996).
- Solomon, P. R., Vander Schaaf, E. R., Thompson, R. F., Weisz, D. J. Hippocampus and trace conditioning of the rabbit’s classically conditioned nictitating membrane response. Behav Neurosci. 100 (5), 729-744 (1986).
- Moyer, J. R., Deyo, R. A., Disterhoft, J. F. Hippocampectomy disrupts trace eye-blink conditioning in rabbits. Behav Neurosci. 104 (2), 243-252 (1990).
- Weiss, C., Bouwmeester, H., Power, J. M., Disterhoft, J. F. Hippocampal lesions prevent trace eyeblink conditioning in the freely moving rat. Behav Brain Res. 99 (2), 123-132 (1999).
- Weiss, C., Disterhoft, J. F. Exploring prefrontal cortical memory mechanisms with eyeblink conditioning. Behav Neurosci. 125 (3), 318-326 (2011).
- Aiba, A., et al. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mGluR1 mutant mice. Cell. 79 (2), 377-388 (1994).
- Skelton, R. W. Bilateral cerebellar lesions disrupt conditioned eyelid responses in unrestrained rats. Behav Neurosci. 102 (4), 586-590 (1988).
- Takehara, K., Kawahara, S., Takatsuki, K., Kirino, Y. Time-limited role of the hippocampus in the memory for trace eyeblink conditioning in mice. Brain Res. 951 (2), 183-190 (2002).
- Weiss, C., Disterhoft, J. F. Evoking blinks with natural stimulation and detecting them with a noninvasive optical device: A simple, inexpensive method for use with freely moving animals. J Neurosci Meth. 173, 108-113 (2008).
- Royer, S., et al. Control of timing, rate and bursts of hippocampal place cells by dendritic and somatic inhibition. Nature. 15 (5), 769-775 (2012).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Lovett-Barron, M., et al. Dendritic inhibition in the hippocampus supports fear learning. Science. 343 (6173), 857-863 (2014).
- Chettih, S. N., McDougle, S. D., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Adaptive timing of motor output in the mouse: the role of movement oscillations in eyelid conditioning. Front in Integ Neurosci. 5 (72), (2011).
- Heiney, S. A., Wohl, M. P., Chettih, S. N., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Cerebellar-Dependent Expression of Motor Learning during Eyeblink Conditioning in Head-Fixed Mice. J Neurosci. 34 (45), 14845-14853 (2014).
- Siegel, J. J., et al. Trace Eyeblink Conditioning in Mice is Dependent upon the Dorsal Medial Prefrontal Cortex, Cerebellum, and Amygdala: Behavioral Characterization and Functional Circuity. eNeuro. , (2015).
- Galvez, R., Weiss, C., Cua, S., Disterhoft, J. A novel method for precisely timed stimulation of mouse whiskers in a freely moving preparation: application for delivery of the conditioned stimulus in trace eyeblink conditioning. J Neurosci Meth. 177 (2), 434-439 (2009).
- Gruart, A., Sánchez-Campusano, R., Fernández-Guizán, A., Delgado-Garcìa, J. M. A Differential and Timed Contribution of Identified Hippocampal Synapses to Associative Learning in Mice. Cereb Cortex. , (2014).
- Weiss, C., et al. Impaired Eyeblink Conditioning and Decreased Hippocampal Volume in PDAPP V717F Mice. Neurobiol Dis. 11 (3), 425-433 (2002).
- Galvez, R., Weiss, C., Weible, A. P., Disterhoft, J. F. Vibrissa-signaled eyeblink conditioning induces somatosensory cortical plasticity. J Neurosci. 26 (22), 6062-6068 (2006).
- Galvez, R., Weible, A. P., Disterhoft, J. F. Cortical barrel lesions impair whisker-CS trace eyeblink conditioning. Learn & Memory. 14 (1), 94-100 (2007).
- Johnson, K. R., Zheng, Q. Y., Erway, L. C. A Major Gene Affecting Age-Related Hearing Loss Is Common to at Least Ten Inbred Strains of Mice. Genomics. 70 (2), 171-180 (2000).
- Tseng, W., Guan, R., Disterhoft, J. F., Weiss, C. Trace eyeblink conditioning is hippocampally dependent in mice. Hippocampus. 14 (1), 58-65 (2004).
- Joachimsthaler, B., Brugger, D., Skodras, A., Schwarz, C. Spine loss in primary somatosensory cortex during trace eyeblink conditioning. J Neurosci. 35 (9), 3772-3781 (2015).
- Boele, H. J. Cerebellar and extracerebellar involvement in mouse eyeblink conditioning: the ACDC model. Front in Cell Neurosci. 3 (19), (2010).
- Koekkoek, S. K. E., Den Ouden, W. L., Perry, G., Highstein, S. M., De Zeeuw, C. I. Monitoring kinetic and frequency-domain properties of eyelid responses in mice with magnetic distance measurement technique. J Neurophysiol. 88 (4), 2124-2133 (2002).
- Ward, R. L., Flores, L. C., Disterhoft, J. F. Infragranular barrel cortex activity is enhanced with learning. J Neurophysiol. 108 (5), 1278-1287 (2012).
