Eyeblink Condicionamiento clásico bigote-señalado en la cabeza de ratones fijo
Summary
The preparation presented here for whisker-signaled eyeblink conditioning in head-fixed mice precisely stimulates specific whiskers while allowing mice to ambulate on a cylindrical treadmill. A whisker stimulation conditioned stimulus (CS) paired with a periorbital shock unconditioned stimulus (US) results in reliable associative learning on this apparatus.
Abstract
Eyeblink conditioning is a common paradigm for investigating the neural mechanisms underlying learning and memory. To better utilize the extensive repertoire of scientific techniques available to study learning and memory at the cellular level, it is ideal to have a stable cranial platform. Because mice do not readily tolerate restraint, they are usually trained while moving about freely in a chamber. Conditioned stimulus (CS) and unconditioned stimulus (US) information are delivered and eyeblink responses recorded via a tether connected to the mouse’s head. In the head-fixed apparatus presented here, mice are allowed to run as they desire while their heads are secured to facilitate experimentation. Reliable conditioning of the eyeblink response is obtained with this training apparatus, which allows for the delivery of whisker stimulation as the CS, a periorbital electrical shock as the US, and analysis of electromyographic (EMG) activity from the eyelid to detect blink responses.
Introduction
condicionamiento del parpadeo es una forma de condicionamiento pavloviano y un sistema modelo para investigar los mecanismos neurales de aprendizaje asociativo y la memoria. Se ha investigado en diversas especies, incluyendo seres humanos, conejos, gatos, ratas y ratones. El paradigma implica la presentación de dos estímulos pareados: un estímulo neutro condicionado (CS; por ejemplo, un tono, un destello de luz, o la estimulación de la barba), y un estímulo no condicionado saliente (Estados Unidos, por ejemplo, un soplo de aire en el ojo, o choque periorbital). Los EE.UU. provoca una respuesta de parpadeo reflejo condicionado (es decir, UR). Finalmente, después de varias presentaciones del emparejado CS-Estados Unidos, el sujeto aprende a asociar el CS con los EE.UU.. Este aprendizaje se manifiesta en forma de una respuesta condicionada (CR), un parpadeo provocado por el CS solo que precede a la presentación de los EE.UU..
condicionamiento del parpadeo en la forma de seguimiento incluye un intervalo libre de estímulo de unos pocos hmilisegundos undred que separa el CS y los EE.UU. (Figura 1). Condicionamiento de huella es una forma de aprendizaje declarativo, ya que requiere el conocimiento de las contingencias de estímulo 1. La brecha temporal requiere que el animal para mantener una neuronal "traza" de la CS en las regiones del cerebro anterior, tales como el hipocampo a fin de que los EE.UU. y el CS en quedar al 1-6. Junto con las regiones del cerebro anterior, vestigios acondicionado también depende del cerebelo 7.
acondicionado Eyeblink es, por lo tanto, un paradigma útil para la investigación de las múltiples facetas de la memoria, incluyendo la adquisición, consolidación y recuperación. Durante condicionamiento del parpadeo, un grupo de control de animales se presenta con estímulos no apareados en orden aleatorio para probar pseudoconditioning o sensibilizados respuestas a la CS que pueden ser causados por la presentación Estados Unidos solamente en lugar de una asociación EC-EI aprendido.
A appara comúnmente utilizadoTus para la investigación de condicionamiento del parpadeo en los roedores es una cámara en la que se permite que los roedores de moverse libremente durante el proceso de formación de 8-10. Con este tipo de aparato, un dispositivo de amarre está normalmente unida a una pieza de cabeza que se fija al cráneo del roedor. La correa de sujeción permite la entrega de los EE.UU. (y a veces el CS) y para transmitir la respuesta del animal a esos estímulos (es decir, la respuesta de parpadeo) 10. La correa de sujeción en sí mismo puede ser modificado en función del tipo de estímulos entregados y cómo se registra la respuesta de parpadeo.
La razón para el uso "de libre movimiento" ratones atados de condicionamiento del parpadeo es que los ratones que luchan contra la restricción. Aunque otras especies pueden ser más susceptibles a la restricción, la principal ventaja del uso de ratones en experimentos de condicionamiento del parpadeo es que la mayoría de los disponibles cepas mutantes genéticamente modificados son cepas de ratón. Además de que luchan, res completosTraint de los ratones se traduce en angustia aguda. Una preparación de ratón de cabeza fija, que minimice el estrés incrementaría la información fisiológica que se puede obtener durante el condicionamiento del parpadeo. Por ejemplo, este sistema permitiría formación de imágenes de las neuronas corticales con 2 fotones microscopía 11.
Preparaciones Head-fija se han utilizado en los experimentos anteriores para formación de imágenes ópticas de la corteza a través de implantes craneales extraíbles, in vivo grabaciones electrofisiológicas del cerebro de roedores con arrays tetrodo, imágenes de calcio de dos fotones en, y también como una plataforma para el condicionamiento del parpadeo en ratones 11 -16.
En el sistema de frente fijo, estimulación y grabaciones fiables se garantizan sin restricción completa del ratón (Figura 2). Un casco como el usado en el sistema de movimiento libre se fija al cráneo del ratón. Durante el entrenamiento, la pieza de cabeza está fijada a un conector que se une a más de baresuna cinta de correr cilíndrica con el fin de estabilizar la cabeza del roedor (Figura 2A). La cinta cilíndrica permite que el ratón para descansar cómodamente, pero si el ratón así lo desea, también permite que se ejecute o caminar. Con el uso de este sistema, los ratones pueden ser entrenados con una vibración bigote como el CS y una descarga eléctrica leve periorbital como los EE.UU. (Figura 1). Los EE.UU. se entrega a través alambres colocados quirúrgicamente debajo de la piel lateral a la vista. El CS se entrega a través de un peine que está unido a un accionador de flexión rectangular de 2 capas (Figura 2B). El peine y el accionador de flexión se unen entonces a una base magnética que se mueve a la posición correcta durante el entrenamiento y se ajusta para la entrega óptima para cada animal individual. El peine se coloca a horcajadas los bigotes seleccionados. Durante la entrega de la CS, se envía una señal al accionador de flexión que desplaza el peine y conduce a la vibración de las patillas 17.
<p class= ""> jove_content Otros estímulos tales como un tono o un destello de luz se han utilizado como estímulos condicionados eficaces en ratones en el pasado 16,18,19. La estimulación de la barba razón se elige para el CS en este paradigma experimental es la dependencia de los animales murinos en su vibrisas para la entrada de información somatosensorial durante la exploración. La estimulación de la barba se ha demostrado que es un CS fiable y eficaz 20. Por otra parte, dado el sustrato cortical bien establecida y organizada del sistema de vibrisas (es decir, la corteza barril), la estimulación de la barba como el CS proporciona una herramienta elegante para el mapeo de los cambios corticales y la plasticidad asociada con el aprendizaje parpadeo acondicionado 20,21. Un sistema de cabezal fijo permite la estimulación precisa de los bigotes seleccionados para comparar las respuestas entre las neuronas y las neuronas que reciben entradas de los bigotes no estimulados estimulados. Por último, muchas cepas de ratones muestran la pérdida de audición relacionada con la edad como adultos relativamente jóvenes <sup> 22, y el cierre de los párpados durante el parpadeo acondicionado altera un CS visual (aunque un CS visual hace aminorar los problemas con respuestas de sobresalto 16). estimulación Whisker no se ve afectada por cualquiera de estas complicaciones.Aquí se presentan son modificaciones únicas e importantes sobre otras preparaciones de cabeza-fijo para condicionamiento del parpadeo, incluyendo procedimientos para la administración de CS y Estados Unidos, y la adquisición de la respuesta de parpadeo. La fiabilidad de este aparato y el paradigma de la formación en el condicionamiento del parpadeo se demuestra por las curvas de ratones con aire acondicionado y una curva de aprendizaje relativamente plana de los animales de control pseudoconditioned (Figura 7A) el aprendizaje.
Protocol
Representative Results
Discussion
parpadeo acondicionado clásica es una forma de aprendizaje asociativo que es una herramienta útil para la comprensión de los sustratos neurales aprendizaje y la memoria subyacentes. Los métodos anteriores utilizados para el acondicionamiento del parpadeo en roedores como ratones involucrados una cámara que permitió que el animal se mueva libremente. Una preparación de cabeza fija para el acondicionamiento del parpadeo en ratones, utilizando el aparato descrito por Chettih et al., Y Heiney et al.,</em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el Departamento de Defensa (W81XWH-13-01-0243) y los Institutos Nacionales de Salud (R37) AG008796. Agradecemos a Alan Baker en el taller de maquinaria para la construcción de la Universidad de Northwestern el aparato de cilindro de cabeza fija. Agradecemos al Dr. Shoai Hattori por su orientación en MATLAB y Solidworks. Agradecemos al Dr. John Power para el software LabView que controló el experimento.
Materials
| Exervo TeraNova Foam Roller 36" x 6" | Amazon | B002ONUM0E | For cylinder |
| Plexiglas | Custom-made; 1 cm thick | ||
| Metal Rods (12.7mm diameter) | Custom-made | ||
| 4-40 machine screw (.25 in long) | Amazon Supply | B00F33Q8QO | For cylinder |
| Classic Design Hair Comb | Conair | 93505WG-320 | For whisker stimulation |
| 2-Layer Rectangular Bending Actuator | Piezo Systems | T220-A4-303X | For whisker stimulation |
| Solder and Flux Kit | Piezo Systems | MSF-003-NI | For whisker stimulation |
| Magnetic Base | Thor Labs | MB175 | For whisker stimulation |
| Threaded rod for magnetic base | Custom-made | ||
| Strips based on 221 series nylon strip connectors from Electronic Connector Corp. | Custom-made, based on Weiss and Disterhoft, 2008 | ||
| TO-220 Style Transistor | Amazon Supply | B0002ZPZYO | For connector; for the wings |
| Relia-Tac Sockets | Electronic Connector Corp. | 220-S02 | For connector |
| Relia-Tac Pins | Electronic Connector Corp. | 220-P02 | For headpiece |
| 0-80 stainless steel machine screw (1 in. long) | Amazon Supply | B000FN68EE | Locking Screw |
| 0-80 stainless steel machine screw hex nut (5/32 in. thick) | Amazon Supply | B000N2TK7Y | Locking Screw Head |
| Loctite Super Glue-Liquid | Loctite | 1365896 | Cyanoacrylic glue; for the locking screw |
| Quick Setting Epoxy | Ace Hardware | 18613 | For connector and whisker stimulation system |
| Ethernet Cable Wires | Ethernet cable can be taken apart to use the individual wires for the connector | ||
| Polyimide coated stainless steel wires (2 in. long, .005 in. diameter) | PlasticsOne | 005sw/2.0 37365 S-S | For headpiece, EMG and shock wires |
| Stainless steel uncoated wire (.005 in. diameter) | AM Systems | 792800 | For headpiece, ground wires |
| Tenma Variable Autotransformer | Tenma | 72-110 | For the whisker stimulation; rheostat to adjust current to the bending actuator |
| Amplifier | A-M Systems | 1700 | Amplifier for filtering and amplifying EMG signals |
| WPI A385R stimulus isolator | World Precision Instruments | 31405 | For the electrical shock |
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein: Animal Health | 50031 | For surgery; anesthesia |
| Buprenex Injectable CIII | Reckett Benckiser Pharmaceuticals Inc | NDC 12496-0757-1 | For surgery; analgesic |
| Akwa Tears: Lubricant Ophthalmic Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | Artificial tear ointment to prevent dry eyes while under anesthesia |
| Povidine-Iodine Prep Pads | PDI | NDC 10819-3883-1 | For surgery; antiseptic |
| Alcohol Prep Pads | May be purchased from any standard pharmacy | ||
| Stainless steel surgical scalpel handles (no.3) | Integra Miltex | 4-7. | For surgery |
| Stainless steel surgical scalpel blades | Integra Miltex | 4-310 or 4-315 | For surgery; number 10 or 15 scalpel blade |
| 3% Hydrogen Peroxide | May be purchased from any standard pharmacy | ||
| Micro Clip | Roboz | RS-5459 | For surgery, to hold back skin |
| 00-90 stainless steel machine screw (0.0625 in. long) | Amazon Supply | B002SG89X4 | For surgery, to wrap ground wire around |
| Professional Rotary Tool | Walnut Hollow | 29637 | Hand drill for surgery, to drill holes in skull |
| Inverted Cone Burr | Roboz | RS-6282C-34 | Inverted cone burr size 34; for surgery, to drill holes in skull |
| Engraving Cutter Drill Bit | Dremel | 106 | Engraving cutter; 1.6 mm bit; for surgery, to drill holes in skull |
| C&B Metabond-Quick! Cement System "B" Quick Base | Parkell | S398 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System Clear L-Powder | Parkell | S399 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System "C" Universal TBB Catalyst 0.7 ml | Parkell | S371 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System Ceramic Mixing Dish with temperature strip | Parkell | S387 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| Swiss Tweezers, style #5 | World Precision Instruments | 504506 | For surgery |
| Puritan Cotton-Tipped Applicators | VWR International | 10806-005 | For surgery |
| Dental Caulk Grip Cement Kit | Dentsply | 675570 | For surgery; dental cement |
References
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