כימות של גרורות סרטן השחלות תוך הצפק
Summary
Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.
Abstract
Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.
Introduction
סרטן שחלות אפיתל (EOC) הוא הגורם השכיח ביותר למוות ממאיר גינקולוגיות, עם אבחנות חדשות 21,290 המשוער בארה"ב בשנת 2015 ו 1 14,180 מקרי מוות. הרוב המכריע (> 75%) של נשים מאובחנים עם מחלה בשלב מאוחר (שלב III או IV) מאופיין גרורות תוך הצפק מפוזרות פרוגנוזה גרועה. ישנות מחל חלל הצפק בעקבות כימותרפיה כקו הראשון הן גם נפוצות ומייצג אחד גורמים עיקריים של 2,3 תמותה. EOC גרורה ידי מנגנון ייחודי המעורבים הוא המשך ישיר מן הגידול הראשוני לאיברים הצפק שכנות כמו גם על ידי ניתוק או שפיכת התאים מפני שטח גידול הראשוני כמו תאים בודדים או אגרגטים רבים תאיים. תאים הם לשפוך לתוך חלל הצפק, שבה הם להתנגד הנגרמת ניתוק אפופטוזיס 4. הצטברות של מיימת הצפק שכיחה, כפי תאים סרטניים לשפוך לחסום ניקוז לימפטי הצפק tumors לייצר גורמי גדילה אשר משנים חדירות כלי הדם. חלק של תאים סרטניים לשפוך לצרף אל פני השטח של איברים הצפק ומבנים כולל המעי, הכבד, omentum ו לפדר, ואז הם לעגן מתרבים כדי לייצר נגעים משניים מרובים לתפוצה רחבה 3,5. גרורות Hematogenous הן נדירות. לפיכך, ניהול קליני מורכב בדרך של ניתוח cytoreductive כולל "debulking אופטימלי", המוגדר כריתה של כל הגידול גלוי (לא משנה כמה קטן). Cytoreduction השלם קשור לעלייה משמעותית בהישרדות הכוללת 6,7 והיא קשורה עם האתגר של זיהוי והסרה של נגעים <0.5 סנטימטר.
במודלים של בעלי חיים קטנים הוכיחו שירות במחקר סרטן השחלות בשיפור ההבנה שלנו של התקדמות מחלה וכן יש להציג תעודת מזהה של סמנים פרוגנוסטיים ובדיקה של תרופות רומן או גישות טיפול משולב. ככל העיקריהאתר של שכיחות סרטן השחלות גרורות הוא חלל הצפק, מודלים orthotopic של גרורות EOC כרוך בניתוח ואפיון של המחלה intraperitoneal. למרות חלו שיפורים אחרונים ביכולת תאים סרטני תמונה, אפילו ברמה של התא הבודד, עדיין קיימים קשיים משמעותיים בכימות ניטל גידול גרורתי של EOC. אתגרים אלה נובעים בשל מספר, גודל ומיקום אנטומי של גרורות. יתר על כן קיים צורך לתאי סרטן התווית כדי להבדילם תאי מארחים נורמלים. מחקרים קודמים מנוצלים פרוטוקולי תיוג מבוסס נוגדן או transfection של תאים סרטניים עם 8,9 בלוציפראז. תיוג פלורסנט ישיר של תאים סרטניים דווח לראשונה על ידי Chishima ועמיתים לעבודה בשנת 1997 10. תוויות פלורסנט אינן דורשות תוספת של מצע אקסוגניים ולספק סגולי תאים סרטניים מעודן, מתן אמצעים יעילים יותר כדי לעקוב אחר גרורות סרטן 11,12 </sup>.
בזאת אנו מתארים שיטת הדמיה אופטית ניתוח כמותי של מחלה גרורתית באמצעות מודל xenograft orthotopic syngeneic המורכב חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) -tagged בתאי סרטן שחלות murine ID8 13 ועכברים חיסוני המוסמכות C57 / BL6. אנו מדגימים שיטה חדשה של כימות נטל הגידול היחסי שילוב in vivo לשעבר vivo הדמיה עם הסרת פלואורסצנציה אוטומטי רקמות. לגישה הזאת יש פוטנציאל השירות במחקרים שנועדו להעריך את ההשפעה של שינויים ספציפיים גנטיים, אפיגנטיים או מיקרו-סביבתיים ו / או שיטות טיפול על גרורות איבר ספציפי של סרטן השחלות.
Protocol
Representative Results
Discussion
בניגוד למחקרים באמצעות תאי סרטן שחלות אדם חייב להתנהל בעכברי immunocompromised, הפרוטוקול המתואר לעיל מנצל מערכת חיסון תקין עכברי C57 / BL6 ותאי סרטן שחלות murine syngeneic. אמנם זה מאפשר הערכה של פוטנציאל התפקיד של מחלחל חיסוני התקדמות גידול וגרור, הנוכחות של שיער כהה על פני שטח הבטן ה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by research grants RO1CA109545 and RO1CA086984 to M.S.S. by the National Institutes of Health/National Cancer Institute and by an award from the Leo and Ann Albert Charitable Trust (to M.S.S.).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning | 10-014-CM | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437-028 | |
| penicillin/streptomycin | |||
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I-1884 | |
| Bruker Xtreme small animal imaging system | Bruker Corp. | ||
| Bruker Multispectral software | Bruker Corp | ||
| lentiviral particles with Red fluorescent protein | GenTarget, Inc. | LVP023 | |
| trypsin for cell culture | Corning | 25-053-CI | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion) | purchases from drugstore | n/a | |
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | free download | |
| dissecting tools (forceps) | Roboz Surgical Instrument | RS 5130 | |
| dissecting tools (Scissors) | Roboz Surgical Instrument | RS 5910 |
References
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
- Halkia, E., Spiliotis, J., Sugarbaker, P. Diagnosis and management of peritoneal metastases from ovarian cancer. Gastroenterology Research and Practice. 2012, 541842-541854 (2012).
- Barbolina, M. V., et al. Microenvironmental regulation of ovarian cancer metastasis. Cancer Treatment and Research. 149, 319-334 (2009).
- Lengyel, E., et al. Epithelial ovarian cancer experimental models. Oncogene. 33 (28), 3619-3633 (2014).
- Harter, P., duBois, A. The role of surgery in ovarian cancer with special emphasis on cytoreductive surgery for recurrence. Current Opinion in Oncology. 17 (5), 505-514 (2005).
- Bristow, R. E., Puri, I., Chi, D. S. Cytoreductive surgery for recurrent ovarian cancer: a meta-analysis. Gynecologic Oncology. 112 (1), 265-274 (2009).
- Hoffman, R. M. In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins. Cell Death and Differentiation. 9, 786-789 (2002).
- Sweeney, T. J., et al. Visualizing the kinetics of tumor-cell clearance in living animals. Proceedings of the National Academy of Science USA. 96, 12044-12049 (1999).
- Chishima, T., et al. Cancer invasion and micrometastasis visualized in live tissue by green fluorescent protein expression. Cancer Research. 57, 2042-2047 (1997).
- Bouvet, M., et al. Real-time optical imaging of primary tumor growth and multiple metastatic events in a pancreatic cancer orthotopic model. Cancer Research. 62, 1534-1540 (2002).
- Hoffman, R. M. The Multiples Uses of Fluorescent Proteins to Visualize Cancer in vivo. Nature Reviews. 5, 796-806 (2005).
- Roby, K. F., et al. Development of a syngeneic mouse model for events related to ovarian cancer. Carcinogenesis. 21 (4), 585-591 (2000).
- Rampurwala, M., Ravoori, M. K., Wei, W., Johnson, V. E., Vikram, R., Kundra, V. Visualization and quantification of intraperitoneal tumors by in vivo computed tomography using negative contrast enhancement strategy in a mouse model of ovarian cancer. Translational Oncology. 2 (2), 96-106 (2009).
- Kim, T. J., et al. Antitumor and antivascular effects of AVE8062 in ovarian carcinoma. Cancer Research. 67, 9337-9345 (2007).
- Picchio, M., et al. Advanced ovarian carcinoma: usefulness of [(18)F]FDG-PET in combination with CT for lesion detection after primary treatment. Quarterly Journal of Nuclear Medicine. 47, 77-84 (2003).
