Количественное внутрибрюшинным метастаз рака яичников
Summary
Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.
Abstract
Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.
Introduction
Эпителиальный рак яичников (EOC) является наиболее распространенной причиной смерти от гинекологических злокачественных новообразований, с предполагаемой 21,290 новых диагнозов в США в 2015 году и приблизительно 14,180 смертей 1. Подавляющее большинство (> 75%) женщин с диагнозом поздней стадии заболевания (стадия III или IV) характеризуется диффузным внутрибрюшинным метастазирования и неблагоприятным прогнозом. Рецидив заболевания в брюшной полости следующей химиотерапии первой линии является обычным явлением и представляет собой основную причину смертности 2,3. EOC метастазирует с помощью уникального механизма с участием как прямое расширение первичной опухоли в соседние органы брюшины, а также путем диссоциации или пролития клеток с поверхности первичной опухоли в виде отдельных клеток или многоклеточных агрегатов. Клетки пролил в брюшную полость, в которой они сопротивляются отряду индуцированный апоптоз 4. Скопление перитонеального асцита является обычным явлением, поскольку проливают опухолевые клетки блокируют перитонеальный лимфатический дренаж и тumors производят факторы роста, которые изменяют проницаемость сосудов. Часть пролитой опухолевых клеток прикрепляются к поверхности перитонеальных органов и структур , включая кишечник, печень, сальник и брыжейку, вследствие чего они пролиферируют и якорь для получения множества широко распространяемых вторичных поражений 3,5. Гематогенное метастаз редко. Таким образом, клиническое лечение обычно не состоит из циторедуктивного хирургии, включая "оптимальной циторедукция", которая определяется как резекция всей видимой опухоли (независимо от того, насколько мал). Полная циторедукции связано со значительным увеличением общей выживаемости 6,7 и связано с проблемой выявления и устранения повреждений <0,5 см.
Мелкие животные модели доказали полезность в исследованиях рака яичников в улучшении нашего понимания прогрессирования заболевания, а также в выявлении прогностических биомаркеров и тестирования новых химиотерапевтических препаратов или подходов комбинированной терапии. Как основнойсайт яичников заболеваемости раком и метастазирования является брюшная полость, ортотопической модели EOC метастазирования включают анализ и характеристику внутрибрюшинного болезни. Хотя были недавние улучшения в способности к опухолевым клеткам изображения, даже на уровне одной клетки, по-прежнему существуют значительные трудности в количественной оценке метастатического бремя опухоли EOC. Эти проблемы возникают из-за количества, размера и анатомического расположения метастатических поражений. Кроме того, существует потребность в раковых клетках этикетки, чтобы отличить их от нормальных клеток-хозяев. Предыдущие исследования использовали антитела на основе протоколов маркировки или трансфекции опухолевых клеток с помощью люциферазы 8,9. Прямое флуоресцентное мечение раковых клеток было впервые сообщено Тисима и соавторами в 1997 году 10. Флуоресцентные метки не требуют добавления экзогенного субстрата и обеспечивают изысканную опухолевых клеток специфичность, обеспечивая более эффективные средства для отслеживания метастазирования рака 11,12 </suр>.
Здесь мы опишем метод оптической визуализации для количественного анализа метастазами с использованием сингенную ортотопической модели ксенотрансплантата , состоящий из красного флуоресцентного белка (RFP) -tagged мышиного ID8 клеток рака яичников 13 и иммунокомпетентных мышам C57 / НД6. Мы демонстрируем новый метод относительного опухолевой количественного сочетания в естественных условиях и естественных изображений экс с удалением ткани автофлуоресценции. Такой подход имеет потенциальное применение в исследованиях, направленных на оценку влияния конкретных генетических, эпигенетических или микро-экологических изменений и / или методов лечения на органоспецифической метастазирования рака яичников.
Protocol
Representative Results
Discussion
В отличие от исследований с использованием клеток рака яичников человека, которые должны быть проведены в ослабленным иммунитетом мышей, протокол, описанный выше, использует иммунокомпетентных мышей C57 / НД6 и сингенных мышиных клеток рака яичников. Хотя это позволяет проводить оценку…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by research grants RO1CA109545 and RO1CA086984 to M.S.S. by the National Institutes of Health/National Cancer Institute and by an award from the Leo and Ann Albert Charitable Trust (to M.S.S.).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning | 10-014-CM | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437-028 | |
| penicillin/streptomycin | |||
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I-1884 | |
| Bruker Xtreme small animal imaging system | Bruker Corp. | ||
| Bruker Multispectral software | Bruker Corp | ||
| lentiviral particles with Red fluorescent protein | GenTarget, Inc. | LVP023 | |
| trypsin for cell culture | Corning | 25-053-CI | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion) | purchases from drugstore | n/a | |
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | free download | |
| dissecting tools (forceps) | Roboz Surgical Instrument | RS 5130 | |
| dissecting tools (Scissors) | Roboz Surgical Instrument | RS 5910 |
References
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
- Halkia, E., Spiliotis, J., Sugarbaker, P. Diagnosis and management of peritoneal metastases from ovarian cancer. Gastroenterology Research and Practice. 2012, 541842-541854 (2012).
- Barbolina, M. V., et al. Microenvironmental regulation of ovarian cancer metastasis. Cancer Treatment and Research. 149, 319-334 (2009).
- Lengyel, E., et al. Epithelial ovarian cancer experimental models. Oncogene. 33 (28), 3619-3633 (2014).
- Harter, P., duBois, A. The role of surgery in ovarian cancer with special emphasis on cytoreductive surgery for recurrence. Current Opinion in Oncology. 17 (5), 505-514 (2005).
- Bristow, R. E., Puri, I., Chi, D. S. Cytoreductive surgery for recurrent ovarian cancer: a meta-analysis. Gynecologic Oncology. 112 (1), 265-274 (2009).
- Hoffman, R. M. In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins. Cell Death and Differentiation. 9, 786-789 (2002).
- Sweeney, T. J., et al. Visualizing the kinetics of tumor-cell clearance in living animals. Proceedings of the National Academy of Science USA. 96, 12044-12049 (1999).
- Chishima, T., et al. Cancer invasion and micrometastasis visualized in live tissue by green fluorescent protein expression. Cancer Research. 57, 2042-2047 (1997).
- Bouvet, M., et al. Real-time optical imaging of primary tumor growth and multiple metastatic events in a pancreatic cancer orthotopic model. Cancer Research. 62, 1534-1540 (2002).
- Hoffman, R. M. The Multiples Uses of Fluorescent Proteins to Visualize Cancer in vivo. Nature Reviews. 5, 796-806 (2005).
- Roby, K. F., et al. Development of a syngeneic mouse model for events related to ovarian cancer. Carcinogenesis. 21 (4), 585-591 (2000).
- Rampurwala, M., Ravoori, M. K., Wei, W., Johnson, V. E., Vikram, R., Kundra, V. Visualization and quantification of intraperitoneal tumors by in vivo computed tomography using negative contrast enhancement strategy in a mouse model of ovarian cancer. Translational Oncology. 2 (2), 96-106 (2009).
- Kim, T. J., et al. Antitumor and antivascular effects of AVE8062 in ovarian carcinoma. Cancer Research. 67, 9337-9345 (2007).
- Picchio, M., et al. Advanced ovarian carcinoma: usefulness of [(18)F]FDG-PET in combination with CT for lesion detection after primary treatment. Quarterly Journal of Nuclear Medicine. 47, 77-84 (2003).
