A quantificação da Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metástase

Summary

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

Abstract

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

Introduction

Câncer epitelial de ovário (EOC) é a causa mais comum de morte por neoplasia ginecológica, com uma estimativa de 21,290 novos diagnósticos em os EUA em 2015 e uma estimativa de 14,180 mortes ^1. A grande maioria (> 75%) das mulheres são diagnosticadas com a doença de fase final (fase III ou IV), caracterizado por difuso metástases intra-peritoneal e mau prognóstico. A recorrência da doença na cavidade peritoneal na sequência da primeira linha de quimioterapia também é comum e representa uma das principais causas de mortalidade ^2,3. EOC metastasizes por um único mecanismo envolvendo tanto extensão directa do tumor primário para órgãos peritoneais vizinhas, assim como pela dissociação ou derramamento de células da superfície do tumor primário, como células individuais ou agregados multicelulares. As células são vertidos para dentro da cavidade peritoneal, em que eles resistir apoptose induzida por descolamento ^4. Acúmulo de ascite peritoneal é comum, como as células tumorais derramam bloquear a drenagem linfática peritoneal e tumors produzem fatores de crescimento que alteram a permeabilidade vascular. Uma porção de células tumorais vertente anexar à superfície de órgãos e estruturas peritoneais incluindo intestino, fígado, mesentério e omento, após o que ancorar e proliferam para produzir múltiplas lesões secundárias amplamente disseminadas ^3,5. metástase hematogênica é incomum. Assim, a gestão clínica comumente consiste em cirurgia cytoreductive incluindo "debulking óptima", definida como a ressecção de todo o tumor visível (não importa quão pequena). Citorredução completa está associada a um aumento significativo na sobrevivência global ^6,7 e está associada com o desafio da identificação e da remoção de lesões <0,5 cm.

modelos animais pequenos têm demonstrado utilidade na pesquisa do câncer de ovário em melhorar o nosso entendimento da progressão da doença, bem como em identificação de biomarcadores de prognóstico e ensaio de novas quimioterapias ou abordagens de terapia de combinação. À medida que o primáriolocal de incidência de câncer de ovário e metástase é a cavidade peritoneal, modelos ortotópicos de EOC metástase envolvem a análise e caracterização da doença intraperitoneal. Embora tenha havido recentes melhorias na capacidade de células tumorais imagem, mesmo ao nível de uma única célula, ainda existem dificuldades significativas na quantificação da carga de tumor metastático de EOC. Estes desafios surgem devido ao número, tamanho e localização anatômica das lesões metastáticas. Além disso, existe uma necessidade para células de cancro da etiqueta para distingui-las das células hospedeiras normais. Estudos anteriores utilizaram protocolos de rotulagem baseadas em anticorpos ou a transfecção de células de tumor com ^8,9 luciferase. A marcação directa fluorescente de células cancerosas foi relatada pela primeira vez por Chishima e colaboradores em 1997 ^10. Os marcadores fluorescentes não necessitam de adição de substrato exógeno e proporcionar especificidade de células tumorais requintado, proporcionando um meio mais eficaz para controlar metástases de cancro ^11,12 </sup>.

Aqui nós descrevemos um método de imagem óptico para análise quantitativa de doença metastática utilizando um modelo de xenoenxerto ortotópico singênico composta de proteína fluorescente vermelha (RFP) tagged ID8 células de câncer de ovário murino ¹³ e camundongos C57 / Bl6 imuno-competente. Nós demonstramos um método novo para a quantificação da carga tumoral em relação combinar imagens in vivo e ex vivo com a remoção de tecido auto-fluorescência. Esta abordagem tem uma utilidade potencial em estudos destinados a avaliar o efeito do específica genética, epigenética ou micro-ambientais modificações e / ou modalidades de tratamento específico nas metástases de órgãos de cancro do ovário.

Protocol

Todos os estudos in vivo foram aprovados pela Universidade de Notre Dame Animal Care e do Comitê Use e usado feminino camundongos C57 / BL6J. Cultura de Células 1. Murino cancro do ovário Adicione o meio de cultura ID8 murino ovário de células de cancro da seguinte forma: 1 L de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 4% de Soro Bovino Fetal (FBS), 1% de Penicilina / Estreptomicina, 5 ug / ml de insulina, 5 ug / ml de transferrina e 5 ng / ml de selen…

Representative Results

O mecanismo metastático do câncer de ovário é caracterizada por metástase intra-peritoneal altamente difuso composto por numerosas lesões de tamanhos variados, incluindo múltiplas (<2mm) pequenas lesões. Assim, a utilização de células tumorais marcadas com RFP (Figura 1) e imagiologia óptica fornece um método alternativo para a contagem manual e medição do tamanho da lesão. O desenvolvimento do peso do tumor ao longo do tempo pode ser determinada por p…

Discussion

Em contraste com os estudos que utilizam células de cancro do ovário humano que devem ser realizados em ratinhos imunocomprometidos, o protocolo descrito acima utiliza imunocompetentes ratinhos C57 / Bl6 e células de cancro do ovário murino singeneicas. Enquanto isto permite avaliar o papel potencial de infiltrados imunes em progressão tumoral e metástases, a presença de cabelo escuro na superfície abdominal torna menos sensível imagiologia. Utilização de um depilatório para remover os pêlos antes da imagem…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning	10-014-CM
Fetal bovine serum	Gibco	10437-028
penicillin/streptomycin
Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement	Sigma	I-1884
Bruker Xtreme small animal imaging system	Bruker Corp.
Bruker Multispectral software	Bruker Corp
lentiviral particles with Red fluorescent protein	GenTarget, Inc.	LVP023
trypsin for cell culture	Corning	25-053-CI
PBS	Corning	21-040-CM
depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion)	purchases from drugstore	n/a
ImageJ software	http://imagej.nih.gov/ij/		free download
dissecting tools (forceps)	Roboz Surgical Instrument	RS 5130
dissecting tools (Scissors)	Roboz Surgical Instrument	RS 5910