इंट्रा-पेरिटोनियल डिम्बग्रंथि के कैंसर मेटास्टेसिस के quantitation
Summary
Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.
Abstract
Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.
Introduction
उपकला डिम्बग्रंथि के कैंसर (ईओसी) gynecologic द्रोह से मौत का सबसे आम कारण, 2015 में अमेरिका में एक अनुमान के अनुसार 21,290 नए निदान और एक अनुमान के अनुसार 14,180 लोगों की मृत्यु 1 के साथ है। महिलाओं की विशाल बहुमत (> 75%) देर चरण रोग के साथ का निदान कर रहे हैं (चरण तृतीय या चतुर्थ) फैलाना इंट्रा-पेरिटोनियल मेटास्टेसिस और गरीब पूर्वानुमान की विशेषता है। पहली लाइन कीमोथेरेपी के बाद पेरिटोनियल गुहा में रोग की पुनरावृत्ति भी आम है और मृत्यु दर 2,3 का एक प्रमुख कारण प्रतिनिधित्व करता है। ईओसी एक अद्वितीय पड़ोसी पेरिटोनियल अंगों को प्राथमिक ट्यूमर से और साथ ही हदबंदी से दोनों प्रत्यक्ष विस्तार या एकल कक्षों या बहु-कोशिकीय समुच्चय के रूप में प्राथमिक ट्यूमर की सतह से कोशिकाओं के बहा से जुड़े तंत्र द्वारा metastasizes। प्रकोष्ठों, पेरिटोनियल गुहा में बहा रहे हैं जिसमें वे टुकड़ी प्रेरित apoptosis 4 का विरोध। पेरिटोनियल जलोदर के buildup, आम है बहाने ट्यूमर कोशिकाओं पेरिटोनियल लसीका जल निकासी और टी ब्लॉक के रूप मेंumors वृद्धि कारक है कि संवहनी पारगम्यता में परिवर्तन का उत्पादन। शेड ट्यूमर कोशिकाओं के एक हिस्से पेरिटोनियल अंगों और आंत, लीवर, omentum और अन्त्रपेशी सहित संरचनाओं की सतह के लिए देते हैं जिस से वे लंगर और कई व्यापक रूप से प्रचारित माध्यमिक घावों 3,5 उत्पादन करने के लिए पैदा करना। Hematogenous मेटास्टेसिस असामान्य है। इस प्रकार, नैदानिक प्रबंधन सामान्यतः (कोई बात नहीं कैसे छोटे) "इष्टतम debulking" सहित साइटोरिडक्टिव शल्य-चिकित्सा, सभी दृश्य ट्यूमर की लकीर के रूप में परिभाषित होते हैं। पूरा cytoreduction समग्र अस्तित्व 6.7 में उल्लेखनीय वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है और पहचान और घावों को हटाने <0.5 सेमी की चुनौती के साथ जुड़ा हुआ है।
छोटे पशु मॉडल शकुन बायोमार्कर और उपन्यास कीमोथेरपी या संयोजन चिकित्सा दृष्टिकोण के परीक्षण की पहचान में रोग प्रगति के बारे में हमारी समझ में सुधार के रूप में अच्छी तरह से या गर्भाशय के कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में उपयोगिता सिद्ध कर दिया है। प्राथमिक के रूप मेंडिम्बग्रंथि के कैंसर के बढ़ते मामलों और मेटास्टेसिस की साइट पेरिटोनियल गुहा, ईओसी मेटास्टेसिस के ओर्थोटोपिक मॉडल विश्लेषण और intraperitoneal रोग के लक्षण वर्णन शामिल है। हालांकि वहाँ छवि ट्यूमर कोशिकाओं की क्षमता में हाल ही में सुधार किया गया है, यहां तक कि एकल कोशिका के स्तर पर, वहाँ अब भी ईओसी की metastatic ट्यूमर बोझ बढ़ाता में महत्वपूर्ण कठिनाइयों मौजूद हैं। इन चुनौतियों संख्या, आकार और मेटास्टेटिक घावों की शारीरिक स्थिति के कारण उत्पन्न होती हैं। इसके अलावा उन्हें सामान्य मेजबान कोशिकाओं से अलग करने के लेबल कैंसर की कोशिकाओं को करने की जरूरत मौजूद है। पिछले अध्ययनों एंटीबॉडी आधारित लेबलिंग प्रोटोकॉल या luciferase 8,9 के साथ ट्यूमर कोशिकाओं के अभिकर्मक का उपयोग किया है। कैंसर कोशिकाओं के प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट लेबलिंग पहली बार 1997 में 10 Chishima और सहकर्मियों द्वारा सूचना मिली थी। फ्लोरोसेंट लेबल बहिर्जात सब्सट्रेट के अलावा आवश्यकता नहीं है और उत्तम ट्यूमर सेल विशिष्टता प्रदान करते हैं, एक अधिक प्रभावी साधन उपलब्ध कराने के कैंसर मेटास्टेसिस 11,12 ट्रैक करने के लिए </sup>।
इस के साथ साथ हम एक syngeneic ओर्थोटोपिक जेनोग्राफ्ट मॉडल लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) के शामिल का उपयोग कर मेटास्टेटिक रोग के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक ऑप्टिकल इमेजिंग विधि का वर्णन -tagged murine ID8 या गर्भाशय के कैंसर की कोशिकाओं को 13 और इम्युनो-सक्षम C57 / BL6 चूहों। हम रिश्तेदार ट्यूमर बोझ गुणात्मक रूप से एक उपन्यास विधि ऊतक ऑटो प्रतिदीप्ति को हटाने के साथ विवो और पूर्व vivo इमेजिंग में संयोजन प्रदर्शित करता है। यह दृष्टिकोण या गर्भाशय के कैंसर का अंग विशेष मेटास्टेसिस पर विशिष्ट आनुवंशिक, epigenetic या सूक्ष्म पर्यावरण संशोधनों और / या इलाज के तौर तरीकों के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए डिज़ाइन अध्ययन में संभावित उपयोगिता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
मानव डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं है कि immunocompromised चूहों में आयोजित किया जाना चाहिए का उपयोग अध्ययन के विपरीत, प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित असुरक्षित C57 / BL6 चूहों और syngeneic murine या गर्भाशय के कैंसर की कोशिकाओं का इस्ते?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by research grants RO1CA109545 and RO1CA086984 to M.S.S. by the National Institutes of Health/National Cancer Institute and by an award from the Leo and Ann Albert Charitable Trust (to M.S.S.).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning | 10-014-CM | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437-028 | |
| penicillin/streptomycin | |||
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I-1884 | |
| Bruker Xtreme small animal imaging system | Bruker Corp. | ||
| Bruker Multispectral software | Bruker Corp | ||
| lentiviral particles with Red fluorescent protein | GenTarget, Inc. | LVP023 | |
| trypsin for cell culture | Corning | 25-053-CI | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion) | purchases from drugstore | n/a | |
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | free download | |
| dissecting tools (forceps) | Roboz Surgical Instrument | RS 5130 | |
| dissecting tools (Scissors) | Roboz Surgical Instrument | RS 5910 |
References
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