In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.
Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.
Under fosterudviklingen, væv og organer morfogenese ske gennem en præcist program, der kan beskrives ved hjælp af celleproliferation, cellemigration og slægt specifikation 1-4. Disse biologiske processer er også involveret i at opretholde homeostase voksent væv, som kræver stamcelle regeneration. Lineage sporing, identifikation og sporing af afkommet af en specifik type celle befolkning, giver et vigtigt redskab til at studere embryogenese og stamceller homeostase. Faktisk er det i stigende grad bliver brugt i mange forskningsområder. Især afstamning sporing blev et vigtigt redskab i at identificere oprindelsen og skæbnen for stamceller i homeostase og kræft udvikling. Dette er fordi det kan give væsentlige oplysninger om, hvordan cellen opfører sig i forbindelse med den intakte væv eller organisme, med minimal eksperimenterende indgreb i modsætning til celleisolering og in vitro kultur eller transplantatipå dette kan resultere i uønsket bias.
Traditionelt farvestoffer, såsom lipidopløselige carbocyanin, der inkorporerer i plasmamembranen i celler, blev anvendt til afstamning sporing. Selv om disse typer af eksperimenter med succes har ført til store opdagelser og formede skelsættende begreber i udviklingsmæssige biologi 5,6, de har nogle begrænsninger, herunder vanskeligheden ved at styre specificitet målrettede celler, den uønskede effekt af farvestoffet på celle adfærd og fortyndingen af etiketten over tid. Nukleotid analog mærkning tilgange har aktiveret dokumentere eksistensen af slow-cykling "label fastholde celler", der formentlig svarer til hvilende stamceller 7,8. Men mens denne teknik kunne påvise tilstedeværelsen af langsomme cykling celler baseret på spredning kinetik over en begrænset periode kunne det ikke give væsentlige indsigter vedrørende funktionaliteten af stamceller. En optimal afstamning sporing methtode bør minimere virkningen af mærkningen på egenskaberne af den markerede celle, dens afkom eller dens naboer. Derudover ville det være fordelagtigt at have kontrol på mærkningen induktion, nemlig at have evnen til at mærke cellepopulationen af interesse på en scene og tidsafhængig måde samt i en enkelt celle (klonal) måde. En stabil og irreversibel mærkning metode, der videregives til alt afkom af grundlæggeren cellen er vigtigt, så etiketten kan bibeholdes over tid, og ikke overføres til naboceller.
For nylig blev genetiske tilgange cellemærkning udviklet. I disse systemer, kan cellespecifikke promotorer anvendes til at udløse Cre-rekombinase ekspression med henblik på at fjerne en loxP-flankeret vejspærring og tillade ekspressionen af reportergener, såsom grønt fluorescerende protein eller Β-galactosidase reportergener 9-13. Denne fremgangsmåde gør det muligt ikke blot sporing af celler og deres afkom, men også tillader celle erolation og molekylær karakterisering. Cellesporing på enkelt celle niveau blev mulig ved induktion af ekspressionen af et enkelt fluorescent reportergen. En vigtig begrænsning ved dette system er, at kun når meget lav procentdel af celler er mærket, er det muligt at adskille og spore individuelle kloner. For at overvinde denne begrænsning flerfarvet reportere kan anvendes. Ved brug af flerfarvet mærkning, kan sporing af forskellen skæbne naboceller i samme niche opnås effektivt 14-17. For nylig blev en række Brainbow (BR) alleler udviklet til afstamning sporing eksperimenter, der muliggør en stokastisk ekspression af multiple fluorescerende reportergener under anvendelse af Cre / lox-systemet. Cre / lox-systemet består af Cre-rekombinase-enzym, som genkender og binder til specifikke DNA-sekvenser, såsom loxP-sites. Efter bindingen af Cre-rekombinase, stedspecifik rekombination forekommer, hvilket bevirker fjernelse af loxP flankeret sekvenser resulting i tilfældig ekspression af forskellige fluorescerende proteiner (mekanismen er beskrevet nedenfor). En række Br linjer er tilgængelige til brug (se anmeldelser 16,18,19). De store forskelle mellem Br stammer omfatter (i) forskelle i antallet af fluorescerende gener indgår i kassetten, der spænder fra 2 (Br 2,0), 3 (Br1.0) til 4 (Br1.1, Br2.1) fluorescerende gener , (ii) tilstedeværelsen af gensidigt orienteret lox-steder for at tillade gen-inversion (Br2.0-2.1), (iii) den type lox steder, der anvendes, og (iv) udtrykket eller stilhed fluorescerende genekspression før Cre aktivering. Det nyligt etablerede Br3 tilbyder en forbedret metode til flerfarvet billeddannelse af neuroner. En af de vigtigste funktioner i denne udskrift er, at det indeholder et nyt sæt fotostabile farnesylerede fluorescerende proteiner, som giver en jævn farvning af de fineste neuronale processer 20.
Vigtigt er det, kan forskellige versioner af Br kassetter indeholder den neuronale specifikke Thy1 promoter eller ubikvitært CAG (CMV) promotor. Endelig, mens nogle af Br transgene mus kan indeholde en enkelt Br transgen, kan andre bestå af flere transgene kopier, hvorved produktionen af et enormt antal af muligheder for farvekombinationer at blive udtrykt i hver celle (se for eksempel 16).
I vores undersøgelse, brugte vi R26R-Confetti mus, som indeholder Br 2.1 kassette 21. Br2.1 er unikt udformet til at tillade Cre-medieret DNA-inversioner og ikke kun ekscisioner grund for den gensidige orientering af loxP-steder (figur 1). Således kan disse inversion / excision begivenheder, der fører til farveændring fortsætte, så længe Cre er til stede 16. Derfor er afgørende for pålidelig celle tracking bruge Br2.1 en inducerbar tidsmæssig Cre ekspressionssystem. Som vist i fig. 1, i Br2.1 indeholder en allestedsnærværende CAG promotor efterfulgt af loxP-flankeret Neo R -cassette, der virker som en transkriptionel vejspærring, er denne efterfulgt af 4 fluorescerende reportergener, der koder for grønt (GFP), gul (YFP), rød (RFP) og cyan (FFP) fluorescerende proteiner, der er placeret i to tandem. Nr fluorescens udtrykkes før Cre aktivering. Induktion af Cre-rekombinase bevirker fjernelse af Neo-R kassetten muliggør tilfældig ekspression af en af de 4 fluorescerende proteiner i en given celle. Det første segment indeholder loxP-flankeret GFP og et omvendt YFP, mens det andet segment indeholder loxP-flankeret RFP og en omvendt FFP. Disse DNA-segmenter kan kontinuerligt inverteres (ved hjælp af loxP der er i omvendt orientering), eller udskåret, så længe Cre-rekombinase er til stede. Derfor bør en forbigående og kontrolleret Cre transgen anvendes. Den Br2.1 kassette giver en fremragende system til at skelne mellem overlappende emissioner på signal placering: udtryk for YFP og RFP er cytoplasmatisk, GFP er kernekraft og den fælles fiskeripolitik er bundet til cellemembranen. GFPog RFP emissioner adskilles let ved konventionel fluorescensmikroskopi. For at adskille emissioner YFP / GFP / FFP, er behov for en spektral konfokal imaging system. Alt i alt det Br2.1 kassetten tillader det tilfældige, inducerbare og væv specifikt udtryk for en ud af fire distinkte fluorescerende gener i hver målrettet celle. I virkeligheden, når et større antal farvekombinationer er nødvendigt, kan man danne homozygote mus, der indeholder 2 alleler af Br2.1, hvilket resulterer i ekspressionen af 2 farve tags for hver celle og til at øge antallet af mulige farvekombinationer til 10 22. Nogle af Br musestammer muliggøre ekspressionen af et langt større antal mulige farvekombinationer da flere kopier af kassetten blev integreret i deres genom 16. Men i de fleste tilfælde de fire farvekombinationer leveres af en enkelt Br2.1 allel er tilstrækkelige. Efter protokollen tilvejebragt her, kan man etablere denne fremgangsmåde under anvendelse af en relativt enkel opsætning af spectral mikroskopi med lidt, hvis noget behov for kalibrering.
Her giver vi en tilpasningsdygtig protokol for anvendelse af R26R-Confetti mus, der indeholder et enkelt Br2.1 allel, for afstamning spore eksperimenter af hornhindens epitel. Dette transgen musestamme er blevet anvendt til at studere oprindelse og skæbne colon 21,23 og hornhindeepitelceller stamceller 22,24, tilstedeværelsen af stamceller aktivitet i tarmkræft 25 og til karakterisering nyre podocyte i focal segmental glomerulosklerose (FSGS) 17.
Lineage sporing forsøg er blevet udført i mange år. De seneste teknologiske forbedringer og fremkomsten af Confetti musestammer åbnet nye muligheder for forskning. Dag, kan forskerne drage fordel af et stort antal kommercielt tilgængelige vævsspecifikke Cre linjer, knockout-mus og transgene mus. Dette giver mulighed for at designe alsidige eksperimentelle systemer til håndtering videnskabelige spørgsmål med grundlæggende ekspertise, undgå besværlig praksis, men samtidig give robuste og pålidelige data.
R26R-Confetti mus er en elegant værktøj til effektiv sporing og undersøgelse af arten og opførsel af celler i en levende organisme. Systemet er nemt at etablere og det giver mulighed for ikke-invasiv slægt sporing af enkelte celler under embryogenese, stamceller regenerering under homeostase eller under forskellige omstændigheder som skade, betændelse og kræft. Den opnåelige data giver en robust description af overlevelsen af målrettede celler, klonal celleekspansion og celle migration, på en kvantificerbar måde. En kritisk skridt ville være at vælge den relevante genetiske mus stamme, der kan pålideligt muliggøre en effektiv væv specifik mærkning på en præcis udviklingsstadiet. En begrænsning ved dette system er, at til overvågning af en levende organisme, skal vævet være tilgængelige og gennemsigtige. Tilsvarende sporing af en tyk væv i et levende dyr kan kun lettes ved to-foton eller multi-foton mikroskopi. Men cellesporing er mulig på postmortem vævssnit og måske det intakte væv kan undersøges, efter at den er blevet transformeret til bliver gennemsigtig ved CLARITY metode 32,33. En anden begrænsning, der skal overvejes, er, at selv om tilstødende celler, der udtrykker den samme fluorofor sandsynligvis tilhører samme klonale linie, er det også muligt, at de kan være afledt af uafhængige celle oprindelse, der tilfældigt udtrykte samme fluorescerende gen. Denne mulighety bliver meget usandsynlig, når du bruger flere Br alleler at tillade mange farvekombinationer.
I fremtiden kombinere Confetti systemet med tilgængelige genetiske værktøjer (dvs. knockout, Knockin og transgene musemodeller) vil tillade undersøgelsen af gener og deres mutationer i sundhed og patologi. Ligeledes afstamning sporing under forskellige systemer forstyrrelser (dvs. stamceller niche ødelæggelse, laser medieret celle ablation, narkotikabehandling) vil bringe nye indsigter på inddragelse af signalveje i celle skæbne beslutninger. I sidste ende, det kombinatoriske brug af fluorescerende og bioluminescens mærkning, vil genetiske indberettere af signalveje og banebrydende mikroskopi give forskerne et robust system til at lære, hvordan enkelt celler reagerer på deres omgivelser i deres oprindelige miljø.
The authors have nothing to disclose.
RSF has received funding from the European Union’s – Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013]) under grant agreement n° 618432 – MC—Epi-Patho-Stem, as well as by the Israeli Science Foundation (218/14).
R26RConfetti transgenic mice homozygous for the Brainbow 2.1 cassette. | Jackson | strain #013731 | |
K14CreERT2 mice | Jackson | strain #005107 | |
tamoxifen | Sigma | T5648 | |
isoflurane USP Terrell | Piramal Critical Care | ||
Carprieve 30 | b.wt | ||
DMSO | Sigma | D2650 | |
DAPI | Sigma | D9542 | used at concentration of 4µg/ml |
Immu Mount | Thermo Scientific | 9990402 | |
LSM 510 Meta laser scanning confocal system hooked to an inverted motorized microscope (Axiovert 200M) equipped with a motorized stage . | Zeiss | The spectral overlap between GFP, YFP and CFG requires the use of spectral imaging which allows the separation of the emission spectra of the fluorescent proteins. Here we use the Zeiss LSM 510 Meta spectral confocal microscope. The Meta detector included in this system has 32 detector elements each collecting emission from a 10-nanometer waveband. This technique termed "spectral fingerprinting" enables the user to set the most adequate limits for waveband filtering. There is a variety of spectral confocal systems that can be used, including Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22). | |
Zen 2009 Imaging Software | Zeiss | ||
Duratears-eye ointment | Alcon |